基于SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法技术

本发明专利技术提供一种基于SLAF-seq技术进行大规模样品基因分型的方法，其是利用SLAF-seq技术降低基因组的复杂度，并对大规模样品进行基因分型。利用该技术对基因组进行高通量测序，对样品进行标记开发、遗传图谱绘制及全基因组关联分析。该方法与传统的方法相比优点在于通量大幅度提高，成本大幅度降低。该方法主要应用于标记开发、遗传图谱绘制及全基因组关联分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供一种基于SLAF-seq技术的大规模样品基因分型方法，其核心技术是利用SLAF-seq技术降低基因组复杂度并进行高通量测序，进行标记开发、遗传图谱绘制及全基因组关联分析。
技术介绍
随着具有高通量、低成本、测序错误率低、测序读长短特点的新一代测序技术和生物信息学的发展，使得该测序技术进行高通量标记开发成为可能。SLAF-seq (SpecificLength Amplified Fragments sequencing)是一种简化基因组深度测序技术,在高通量测序技术的基础上，利用生物信息学方法对目标物种的参考基因组或已知BAC序列进行系统分析，根据基因组的GC含量、重复序列情况和基因组特点等信息，设计标记开发方案，以保证SLAF标签密度、均匀性、效率和分析的准确性。根据基因组特性，利用SLAF-seq技术对大规模样品进行研究，通过数学算法解决传统方法通量低和准确性不高的问题，提高生物学分析的准确性，降低成本，提高效率。目前还未见利用SLAF-seq技术对大规模样品进行基因分型的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用SLAF-seq技术降低基因组复杂度并进行高通量测序的方法，对大规模样品进行研究，通过数学算法解决传统方法通量低和准确性不高的问题，提高生物学分析的准确性，降低成本，提高效率。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其基于SLAFseq技术降低基因组复杂度并进行高通量测序，对大规模样品进行标记开发、遗传图谱图谱、单体型图谱绘制及性状关联分析，包括如下步骤:I)对经性状鉴定的各样品的DNA进行检测；2)对样品基因组的复杂性进行降低处理，获得复杂性降低的DNA样品；3 )利用二级引物库中的引物对复杂性降低后的样品DNA进行PCR扩增，使特异性长度片段扩增前后丰度一致；4)将扩增后的特异性长度片段连接标准测序接头，利用高通量测序技术进行测序;5)对于各样品的测序结果进行比较分析，获得SLAF标记，获得各样品的有效序列；进行遗传图谱绘制或全基因组关联 分析。其中步骤I)通过琼脂糖电泳检测各样品DNA主带是否清晰，有无降解和污染，通过微量分光光度计如Nanodrop 2000检测DNA的浓度及纯度。其中步骤5)是对上述SLAF标签进行多态性分析，对存在多态性的标签中的所有样品进行基因分型，并使用自主研发打分体系进行打分，设置阈值，最终获得SLAF标记；通过上述步骤获得的SLAF标记，可用于遗传图谱绘制、全基因组关联分析。前述的基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其中所述大规模样品是植物、动物或微生物。前述的基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其中所述大规模样品为自然群体、遗传分离群体；所述遗传分离群体为经鉴定的性状分离群体，包括F2、BCUDH等目标性状分离的群体。DNA复杂性降低方法是任何有选择性的减少基因组复杂度的方法，包括限制性内切酶酶切产物PCR扩增或酶切产物选择性吸附。其中最佳酶切方案需满足以下条件:a)保证序列标签在基因组上分布尽可能均匀山)选择特定长度的酶切片段能够保证序列标签的数量；c)选择特定长度的酶切片段避免落在基因组高度重复区。其中最佳酶切方案确定需进行预实验，步骤及满足条件如下:1)通过生物信息学模拟，获得广3套候选方案；2)对样品进行酶切连接、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳；3)电泳结果各样品目标范围内无特异条带，且通过BMP图片解析软件如bmp2txt获得电泳胶图上各位点灰度值，利用灰度值模拟模板量进行扩增倍率分析，模板范围扩增倍率一致性高者即为最佳方案。前述的基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其中所述步骤3)二级引物库是为了利用高通量测序特点，节约测序成本，特为大样本量项目设计的扩增引物，后文中称二级引物，所述二级引物差异序列长度为:T7bp，通过生物信息学方法对ATCG组合进行相似性评估，剔除相似度高序列，保 障组合内序列完全识别。所述的二级引物库中的引物序列如SEQ ID NO 4 112所示。前述的基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其中所述二级引物结合Solexa高通量测序标准引物，测序样品数量将以乘积形式增加，如=Solexa引物用12个，二级引物用96个，即可实现I次1152个样品的测序和数据分类需求；前述的基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其中所述步骤4)中Solexa技术是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis, SBS)的新型测序方法。通过利用单分子阵列实现在小型芯片(FlowCell)上进行桥式PCR反应。由于新的可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。前述的基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其中所述步骤4)中双端测序的优势如下:a)相对于单端测序，双端测序序列有效长度增倍,标记比对、定位更为准确；b) _■级引物序列测序重复I次，提闻喊基准确性，喊基错误率由0.01降低到0.0001。前述步骤4)的标准测序接头为:5，-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3，5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’ 前述的基于测序和 SLAFseq 技术的大规模样品基因分型方法，其中打分体系对SLAF标记分型结果给出基于SNP和深度观测的条件错误率，错误率的计算使用贝叶斯公式，具体方法如下:1)假设某一标记位点有m个等位基因，记为{Al，A2，…Am}，则对特定个体而言，在该位点所有可能的分型种类有mX (m+1)/2种，每种基因型的先验概率为该基因型出现的理论频率，因此纯合基因型先验概率为1/πΓ2，杂合基因型先验概率为2/πΓ2;对于二倍体物种，单次测序杂合基因型两个等位基因Ai，Aj间因测序错误产生交换的概率计算如下:本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于SLAFseq的大规模样品基因分型方法，其基于SLAFseq技术降低基因组复杂度并进行高通量测序，对大规模样品进行标记开发及遗传图谱绘制、全基因组关联分析，包括如下步骤：1）对经性状鉴定的各样品的DNA进行检测；2）对样品基因组的复杂性进行降低处理，获得复杂性降低的DNA样品；3）利用二级引物库中的引物对复杂性降低后的样品DNA进行PCR扩增，使特异性长度片段扩增前后丰度一致；4）将扩增后的特异性长度片段连接标准测序接头，利用高通量测序方式进行测序；5）比较测序结果，获得SLAF标记，进行遗传图谱绘制或全基因组关联分析。

【技术特征摘要】
1.于SLAFseq的大规模样品基因分型方法,其基于SLAFseq技术降低基因组复杂度并进行高通量测序，对大规模样品进行标记开发及遗传图谱绘制、全基因组关联分析，包括如下步骤: 1)对经性状鉴定的各样品的DNA进行检测； 2)对样品基因组的复杂性进行降低处理，获得复杂性降低的DNA样品； 3)利用二级引物库中的引物对复杂性降低后的样品DNA进行PCR扩增，使特异性长度片段扩增前后丰度一致； 4)将扩增后的特异性长度片段连接标准测序接头，利用高通量测序方式进行测序； 5)比较测序结果，获得SLAF标记，进行遗传图谱绘制或全基因组关联分析。2.权利要求1所述的方法，其特征在于，大规模样品来自动物、植物或微生物。3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为自然群体或遗传分离群体；所述遗传分离群体为经鉴定的性状分离群体，包括F2、BCl、DH等目标性状分离的群体。4.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中DNA复杂性降低方法是任何有选择性的减少基因组复杂度的方法，包括限制性内切酶酶切产物PCR扩增或酶切产物选择性吸附。5.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪坤，
申请(专利权)人：北京百迈客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：