本发明专利技术公开了用于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针。本发明专利技术还涉及用于检测牛白细胞粘附缺陷病的实时荧光定量PCR检测方法，所述方法包括本发明专利技术的引物和探针。本发明专利技术还涉及用于检测牛白细胞粘附缺陷病的试剂盒，所述试剂盒包括本发明专利技术的引物和探针。本发明专利技术的实时荧光定量PCR检测方法，用于检测活体牛或非活体牛时，具有操作简便，耗时短，成本低，特异性强，重复性和稳定性高，灵敏度高的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物检测生物
，具体涉及应用实时荧光定量PCR的方法检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针、试剂盒和方法。
技术介绍
牛白细胞粘附缺陷病((bovineleukocyte adhesion deficiency, BLAD)是一种常染色体单基因隐性遗传疾病，它的特征表现为严重的重复性感染、伤口愈合延迟和发育不良，而且还伴有明显的持续性中性粒细胞增多。BLAD发生的分子生物学理论根据是在基因CD18的383的位置上发生点突变，腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即导致在粘附分子CD18的氨基酸128天门冬氨基酸由甘氨酸代替(D128G)。患有BLAD牛的中性粒细胞的白细胞粘附分子的β 2整合素(⑶11a，b，c/⑶18)的表达出现障碍，致使白细胞粘附依赖性功能表现出明显的异常。1983年，报道了一例Holstein小母牛发病，怀疑是白细胞功能障碍，称为粒细胞病。1987年，日本报道有几例Holstein牛与持续性和反复性中性粒细胞病有相似的临床特征。1990年，人们从一头患粒细胞综合症的牛身上发现β 2整合素分子在白细胞上的表达缺陷，这种病与人LAD是非常相似的，因此命名为BLAD。二十多年来已给奶牛业带来了巨大的经济损失。目前本病在澳大利亚、英格兰、法国、美国、日本、德国、荷兰、丹麦和瑞士等国均有发生的报道，2006年我国也发现有BLAD携带牛的报道。近几年来鉴于我国大量引进奶牛及其精液，不可避免地将BLAD带入，而目前有关BLAD的危害性还 没引起人们的高度重视，目前国内外通过PCR扩增含有基因⑶18的383片段并采用限制性内切酶分析，人们可以将正常，BLAD携带者和BLAD患病动物区分开来。Tajima等用一对引物扩增大约600 bp的片段，使用TaqI处理后健康牛产生100 bp,200 bp,300 bp三个片段，BLAD牛产生200 bp,400 bp 二个片段，而BL AD携带牛则出现 100 bp,200 bp,300 bp,400 bp 四个片段。基于PCR方法结合限制性内切酶分析的DNA检测技术可以用于本病的诊断，但在实际应用中有其弊病，结果的判定不够客观，过程繁琐且需经过限制性内切酶酶切和测序鉴定等。双探针实时荧光定量PCR检测牛白细胞粘附缺陷病的基因分型方法，其原理是针对同一 SNP位点的不同基因型设计两条不同的探针，把它们同时加入到PCR反应体系中，只有与靶序列完全匹配的探针才能被水解并释放出荧光信号。两条探针分别标记不同的荧光基团，分别用实时荧光定量PCR仪中对应的荧光检测通道检测荧光信号。某种基因型对应的荧光探针能够释放荧光信号，说明在原始DNA样本中含有该种基因型。如果只有一条探针能释放荧光信号，那么检测的SNP位点上是纯合子，要么为健康牛，要么为发病牛；如果两条探针都有荧光信号，那么在该SNP位点上是杂合子，为疾病基因携带者。有鉴于此，本专利技术人对牛白细胞粘附缺陷病的检测进行了改进，本案由此产生。
技术实现思路
本专利技术的一个目的，在于提供检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针、试剂盒和方法。本专利技术针对牛白细胞粘附缺陷病的CD18基因突变的特点，设计了一种特异检测引物及探针、另提供了含此特异检测引物及探针的试剂盒及检测方法，该方法具有操作简便，耗时短，成本低，特异性强，重复性和稳定性高，灵敏度高的特点。本专利技术设计的特异性检测引物及探针，以及提供的试剂盒和检测方法，既可以用于活体牛的检测，又可用于非活体牛的检测。为达成上述目的，本专利技术的技术解决方案是: 一种检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针，引物包括上游引物及下游引物，其序列如下: 上游引物:5’ - TTGCGTTCAACGTGACCTTC-3’ ； 下游引物 5’ - TCACCCCCCAGCTTCTTG -3’。探针包括突变型等位基因探针及野生型等位基因探针，其序列如下: 突变型等位基因探针:HEX-5’ -CCATCGGCCTGTAC-3’ -MGB ； 野生型等位基因探针:FAM-5’ -CCCATCGACCTGTACT-3’ -MGB。一种检测牛白细胞粘附缺陷病的试剂盒，含有如上述所述的引物和探针。一种检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，包括如下步骤:提取牛血总DNA ;配制实时荧光定量PCR反应体系；进行实时荧光定量PCR反应；根据扩增曲线进行结果判定。进一步，实时荧光定量PCR反应体系(50 μ L)的配制如下: TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2 X)25 μ L ； 上游引物(ΙΟμπιοΙ/L)lyL； 下游引物(ΙΟμπιοΙ/L)I μ L ； 突变型等位基因探针(lOymol/L)luL； 野生型等位基因探针(ΙΟμπιοΙ/L)luL； DNA 模板(25ng/y L)5μ L ； 补水至50 μ L0进一步，实时荧光定量PCR反应包括以下步骤:1)95°C变性 IOmin ； 2)95°C变性30s，60°C退火延伸lmin，循环40次。进一步，根据扩增曲线结果判定如下: 若荧光检测通道检测到HEX荧光信号，即检测到的是突变型等位基因，根据结果判定是病牛； 若荧光检测通道检测到FAM荧光信号，即检测到的是野生型等位基因，根据结果判定是健康牛； 若荧光检测通道即检测到HEX荧光信号又检测到FAM荧光信号，则检测到的是突变型等位基因和野生型等位基因，根据结果 判定是疾病基因携带牛。本专利技术的有益效果为: 1、本专利技术针对牛白细胞粘附缺陷病的CD18基因突变的特点，设计了一种特异检测引物及探针，使用该引物和探针只需要进行一次实用荧光定量PCR反应就能同时快速区分BLAD病牛、BLAD携带牛和健康牛，该方法操作简便，耗时短，成本低，特异性强，重复性和稳定性高，灵敏度高，为本病的大规模检验检疫工作提供了广阔的应用前景。2、本专利技术的检测试剂盒可对牛白细胞粘附缺陷病进行快速检测，样品适用范围广，试剂中均无感染性的和生物安全隐患的成分，使用安全。附图说明图1引物扩增后的1.5%琼脂糖凝胶电泳图。O为空白对照；M为IOObp标准分子量；I 6为6个被测样品。图2探针I阳性质粒标准品扩增曲线图。1 8依次为IO8-1O拷贝数/ μ L。图3探针2阳性质粒标准品扩增曲线图。1 8依次为IO8-1O拷贝数/ μ L。图4部分被检样品和对照样品的检测结果图(I为健康牛样本及其对照样本；2为BLAD阳性对照样本；3为杂合子牛样本和杂合子对照样本；4为空白对照样本)。具体实施例方式一、设计引物和探针 本专利技术选取现有GENNANK中基因CD18的基因序列进行同源性比较，根据其保守区域，通过Primer Express软件和primer 5.0软件设计，并经过大量的反应条件优选，对比试验和验证试验才获得的用于BLAD的特异性引物。所形成的引物组合包含的引物碱基数为18 24个，引物的熔解温度Tm值为56 63°C，引物GC%为40% 60%。同时进行筛选，保留不能形成引物二聚体的引物，所获得的这对引物其扩增的目标片段长度为118bp，得到的引物序列如下: 上游引物:5’ -TTGCGTTCAACGTGACCTTC-3’ ； 下游引物:5’ -T本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针，其特征在于：引物包括上游引物：5’?TTGCGTTCAACGTGACCTTC?3’和下游引物5’??TCACCCCCCAGCTTCTTG??3’；探针包括突变型等位基因探针：HEX?5’?CCATCGGCCTGTAC?3’?MGB和野生型等位基因探针：FAM?5’?CCCATCGACCTGTACT?3’?MGB。
【技术特征摘要】
1.于检测牛白细胞粘附缺陷病的引物及探针，其特征在于:引物包括上游引物:5’ -TTGCGTTCAACGTGACCTTC-3’ 和下游引物 5’ - TCACCCCCCAGCTTCTTG -3，;探针包括突变型等位基因探针:HEX-5’ -CCATCGGCCTGTAC-3’ -MGB和野生型等位基因探针:FAM-5’ -CCCATCGACCTGTACT-3’ -MGB。2.于检测牛白细胞粘附缺陷病的试剂盒，其特征在于:含有如权利要求1所述的引物和探针。3.于检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，其特征在于:使用如权利要求1所述的引物和探针或如权利要求2所述的试剂盒，采用实时荧光定量PCR的方法，包括实时荧光定量PCR反应体系的配制及实时荧光定量PCR反应。4.权利要求3所述的用于检测牛白细胞粘附缺陷病的方法，其特征在于:在实时荧光定量PC...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢明星，彭小莉，刘棠，陈伟玲，王群力，王景明，徐维佳，孙福泉，王伟，
申请(专利权)人：厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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