本发明专利技术公开了PPT1基因在制备诊断骨肉瘤的试剂盒中的用途。本发明专利技术利用NCBI GEO数据检索将符合要求的8套骨肉瘤病例和正常人群基因组mRNA表达芯片数据纳入研究范围，通过对上述芯片数据进行Meta分析，筛选出PPT1基因是差异显著基因，相比正常组织，PPT1基因在骨肉瘤组织中表达上调，并使用荧光实时定量PCR方法验证了上述结论。据此，本发明专利技术还公开了一种诊断骨肉瘤的试剂盒以及利用该试剂盒诊断骨肉瘤的方法。本发明专利技术一方面为研究骨肉瘤的分子机理提供新的思路，另一方面为早期诊断骨肉瘤提供了更为灵敏的诊断试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
一种诊断试剂盒及PPT1基因在其制备中的用途
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种骨肉瘤诊断试剂盒及PPT1基因在制备骨肉瘤诊断试剂盒中的应用。
技术介绍
骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性肿瘤，其主要致病特征为体内增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织，是一种人类骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤。目前，国内筛选该疾病的相关基因主要采用的是基因芯片技术构建表达谱的方法。随着生物技术的发展，实验研究产生了大量的基因芯片数据，并通过基因表达芯片筛选出了影响骨肉瘤发生发展的基因及信号通路，已鉴别出大量差异表达的基因。但是不同的实验平台及样本的差异导致各个基因芯片的分析结果存在很多不一致性。Meta分析可对同一个问题所发表相关研究报告的结果进行收集、统计上的整合，以期获得更准确或更多的结果。这个分析能产生很多显著的差异表达基因，能避免单个研究带来的不正确性。Meta分析是在多个芯片实验研究中识别差异表达基因的强有力工具。此外，用Meta分析能识别出单个研究不能识别的差异基因，并且能有效地降低单个芯片数据的假阳性。本专利技术通过对已发表的骨肉瘤转录组表达数据进行Meta分析，筛选出影响骨肉瘤发生发展的关键基因，并使用荧光实时定量PCR(QPCR)检测验证临床样本中的表达，本专利技术通过生物信息学手段发掘这些基因在骨肉瘤中的作用，从而对骨肉瘤的发病机理进行探究，为其诊断和治疗提供一定的研究基础。
技术实现思路
本专利技术通过对已发表的骨肉瘤转录组表达数据进行Meta分析和QPCR验证，发现PPT1基因在骨肉瘤组织中的表达与在正常组织中的表达存在差异。与正常组织相比，PPT1基因在骨肉瘤组织中表达上调，通过检测PPT1基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有骨肉瘤。本专利技术的目的在于提供PPT1基因在制备骨肉瘤诊断试剂盒中的用途。所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增PPT1基因和管家基因的引物对。SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。上述技术方案中，PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，PCR缓冲液包含：25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4。引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计。优选的实施方案中，扩增PPT1基因的正向引物序列为5’-ATGGTGTCAGATGAATATG-3’，反向引物序列为5’-CATGTACTTATTGGCACAA-3’；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。在本专利技术的一个具体的实施方案中，本专利技术的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。优选逆转录反应液包含：250mMPH8.3的Tris-HCL，375mM的KCL，15mM的MgCl2，50mM的DTT。RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。在本专利技术的一个具体的实施方案中，本专利技术的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。本专利技术的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。本专利技术的又一个目的在于提供一种诊断骨肉瘤的试剂盒。所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增PPT1基因和管家基因的引物对。所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。上述技术方案中，PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，PCR缓冲液包含：25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4。引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；优选的实施方案中，扩增PPT1基因的正向引物序列为5’-ATGGTGTCAGATGAATATG-3’，反向引物序列为5’-CATGTACTTATTGGCACAA-3’；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。在本专利技术的一个具体的实施方案中，本专利技术的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。优选逆转录反应液包含：250mMPHS.3的Tris-HCL，375mM的KCL，15mM的MgCl2，50mM的DTT。RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。在本专利技术的一个具体的实施方案中，本专利技术的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。本专利技术还提供了诊断骨肉瘤的方法，所述方法包括：(1)利用RNA提取试剂提取样本总RNA；(2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；(3)在荧光实时定量PCR仪上将PPT1基因和管家基因进行扩增检测；(4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量；(5)PPT1基因表达上调，表明研究对象为骨肉瘤患者。步骤(1)的具体实施方法为：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：①加入Trizol，室温保存5min；②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/mlTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。步骤(2)的具体实施方法为：用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/LdNTP，0.1mmol/1DTT，30μmmol/1OligodT，200U/μlM-MLVRT，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。步骤(3)的具体实施方法为：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBRGreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl；扩增PPT1基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
PPT1基因在制备骨肉瘤诊断试剂盒中的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增PPT1基因和管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
【技术特征摘要】
1.人的PPT1基因在制备骨肉瘤诊断试剂盒中的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增PPT1基因和管家基因的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述扩增PPT1基因的引物对的序列如下：正向引物序列为5’-ATGGTGTCAGATGAATATG-3’，反向引物序列为5’-CATGTACTTATTGGCACAA-3’；所述管家基因是GAPDH，扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGAT...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨祚璋，张娅，陈彦锦，刘雪峰，许达，
申请(专利权)人：杨祚璋，
类型：发明
国别省市：云南;53
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