利用基因芯片检测黄芪甲苷诱导RMMVECs基因表达谱的方法技术

本发明专利技术提供一种利用基因芯片检测黄芪甲苷诱导RMMVECs基因表达谱的方法，包括以下步骤：(1)制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs；(2)培养二代RMMVECs，将黄芪甲苷溶解于维持培养基中，浓度为10μg/ml，在37℃、5％CO2的条件下，将RMMVECs继续培养9h；等九个步骤；本发明专利技术成功培养了RMMVECs，并且利用基因芯片技术从基因表达水平充分验证了，提高微血管舒缩活动振幅的中药有效成分Ast或Ber能双向调节RMMVECs相关细胞因子的表达，维持细胞因子分泌的平衡，维持MVECs的正常生理功能，从而阻断了致病因子对微血管内皮细胞的伤害，发挥治疗疾病的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，尤其是涉及一种利用基因芯片检测黄芪甲苷诱导 RMMVECs基因表达谱的方法。 利用基因芯片检测黄芪甲苷诱导RMMVECs基因表达谱的方 法
技术介绍
基因芯片（gene chip)又称为DNA阵列，为生物芯片的一种，是指将大量DNA或寡 核苷酸探针密集排列形成的探针阵列。基因芯片的技术原理是DNA的碱基配对和互补，基 础是杂交测序（SBH)。基因芯片采用光导原位合成或微量点样的方法，将寡核苷酸或cDNA 有序地固化于支持物的表面，与已标记的待测生物样品的cDNA或cRNA杂交，通过激光共 聚焦扫描等特殊设备对杂交信号的强度进行检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。从 二十世纪八十年代初SBH概念的提出，到目前的商品化基因芯片在这十几年时间里，芯片 的制作技术不断完善、芯片的概念不断延伸、芯片的应用范围不断拓展，使得生物芯片技术 对二十一世纪生命科学和医学的发展产生无法估量的影响。芯片所带来的巨大学术价值、 社会价值和经济价值引起了多家大公司及多国政府机构的极大兴趣，并投以可观的财力， 这又使芯片技术得以迅速发展。 目前基因芯片按功能可以分为表达谱基因芯片和DNA测序芯片两大类；按探针的 长短可分为长探针芯片和短探针芯片。 基因芯片是后基因组时代一项重要技术，它的出现为中医药学的现代化提供了一 个很好的切入点，其特点是可以在同一时刻对成千上万个基因的表达情况进行分析，形成 完整的细胞基因表达谱，解决了传统中药药理研究方法周期长、耗时多、产出少的问题。微 血管内皮细胞能够通过其分泌功能发挥信息的传导和调节功能，保证血液与组织液之间、 血液与淋巴液之间以及血液本身的有形成分与血浆之间复杂的生理、生化以及血流动力 学的内环境平衡，同时分泌多种细胞因子和局部激素，参与一系列生理和病理过程。但是 在现今的微血管内皮细胞的相关研究领域中，基因芯片技术的应用还不是很普遍。张斌 等应用基因芯片技术分别检测正常浓度和高浓度D-葡萄糖培养基中培养后内皮细胞的 基因表达谱。结果表明高糖可能通过影响微血管内皮物质代谢、信号转导、细胞膜结构和 细胞外基质等的表达而导致血管内皮功能素乱，为进一步研究1?糖对微血管内皮细胞基 因表达谱的影响提供资料。ΥμΕ Fei等采用基因芯片技术研究了碱性成纤维细胞生长因 子（basic fibroblast growth factor, bFGF)对小鼠脑微血管内皮细胞（microvasc μ lar endothelial cell, MVEC)株bEnd. 3中血管新生相关基因表达谱的改变，结果提示：bFGF具 有上调促血管新生基因表达，下调抑制血管新生基因表达的作用，两者协同作用，促进血管 新生。
技术实现思路
本专利技术解决的一个技术问题就是通过对黄芪甲苷诱导体外培养的RMMVECs产生 的差异性基因表达谱的分析，来探讨提高微血管舒缩活动振幅的分子机制，从基因表达水 平充分验证了，提高微血管舒缩活动振幅的中药有效成分Ast能双向调节RMMVECs相关细 胞因子的表达，维持细胞因子分泌的平衡，维持MVECs的正常生理功能，从而阻断了致病因 子对微血管内皮细胞的伤害，发挥治疗疾病的作用。 为了解决上述问题，本专利技术提供一种利用基因芯片检测黄芪甲苷诱导RMMVECs基 因表达谱的方法，包括以下步骤： (1)制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs ; (2)培养二代RMMVECs，将黄芪甲苷溶解于维持培养基中，浓度为10 μ g/ml，在 37°C、5% C02的条件下，将RMMVECs继续培养9h ; (3)将RMMVECs充分裂解，提取总RNA ; (4)纯化、定量总RNA ; ⑶反转录合成 First-strand cDNA ; (6)合成 Second-strand cDNA ; (7)体外转录合成cRNA ; (8)cRNA 反转录； (9)荧光标记后进行基因芯片杂交，最后进行数据分析。 所述方法，步骤（1)中采用差速贴壁法对所制备的RMMVECs进行纯化。 所述方法，步骤（3)中充分裂解的方法为：将RMMVECs用37°C预热的PBS清洗3 遍，加入2ml Trizol溶液，静置5min，用移液枪吹打，使RMMVECs充分裂解，转入离心管， 于-80°C冰箱保存待用； 提取总RNA的方法为：将于-80°c冰箱保存的溶于Trizol液中的细胞样品解冻， UOOOrpnufC离心5min，弃沉淀，将上清转入一新的离心管内；按Trizol :氯仿为5 :1的体 积量加入氯仿，剧烈振荡混勻至粉牛奶状，室温静置3min，12000rpm，4°C离心15min，取上 清至一新离心管，加入等体积异丙醇，混勻，室温静置5min，12000rpm，4°C离心15min，可见 白色RNA沉淀；弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇lml，使沉淀悬浮于乙醇中，7500rpm， 4°C离心15min ;弃去上清，再加入75%乙醇lml，重复上步；而后吸去所有上清，待残余乙醇 挥发尽后加入50 μ 1 DEPC水溶解RNA沉淀，-20°C冷冻保存。 所述方法，步骤（5)中反转录合成First-strand cDNA的方法步骤为： E.取总RNA500ng，调整体积到4 μ L ; F.加入基因表达谱外参1 μ 1 ; G.配制反转录 Master Mix，其中 First Strand Β μ ffer Mix4 μ L，First Strand Enzyme Mixl μ L，轻轻混勻，短暂离心置于冰上；取配好的5yL Master Mix分别转移至含 有总RNA样品的0. 2mL离心管中； H.轻轻混匀溶液，瞬时离心后42°C反应2小时；将PCR仪的热盖温度也设置成 42°C,避免溶液蒸到管壁上；反应完后冰浴5分钟。 所述方法，步骤（6)中合成Second-strand cDNA的方法步骤为： D.配制 Second-strand Master Mix，其中 Νμ clease-free Waterl3μ L， Second-strand Buffer Mix5 μ L，Second-strand Enzyme Mix2 μ L，轻轻混勻，短暂离心后 冰浴；取上步反应完毕的样品管中加入配好的20 μ L Second Strand Master Mix ; Ε·轻轻混匀，16°C反应 1 小时，65°C lOmin ; F.反应结束后将反应物置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于-20°C。所述方 法，步骤（7)中体外转录合成cRNA的方法步骤为： E. cRNA 合成：配制体外转录 Master Mix，其中 Ν μ clease-free Water4 μ L， T7B μ ffer Mix20 μ L，T7Enzyme Mix6L，轻轻混勻，短暂离心，往上一反应中准备好的样品 管中加入 30 μ L Master Mix ; F.轻柔混勻，40°C反应16. 5小时； G.反应完成后，准备纯化cRNA ; Η本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用基因芯片检测黄芪甲苷诱导RMMVECs基因表达谱的方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs； (2)培养二代RMMVECs，将黄芪甲苷溶解于维持培养基中，浓度为10μg/ml，在37℃、5％CO2的条件下，将RMMVECs继续培养9h； (3)将RMMVECs充分裂解，提取总RNA； (4)纯化、定量总RNA； (5)反转录合成First‑strand cDNA； (6)合成Second‑strand cDNA； (7)体外转录合成cRNA； (8)cRNA反转录； (9)荧光标记后进行基因芯片杂交，最后进行数据分析。

【技术特征摘要】
2014.04.23 CN 201410165317.01. 利用基因芯片检测黄芪甲苷诱导RMMVECs基因表达谱的方法，其特征在于：包括以 下步骤： (1) 制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs ; (2) 培养二代RMMVECs，将黄芪甲苷溶解于维持培养基中，浓度为lOyg/ml，在37°C、 5% C02的条件下，将RMMVECs继续培养9h ; (3) 将RMMVECs充分裂解，提取总RNA ; (4) 纯化、定量总RNA ; (5) 反转录合成 First-strand cDNA; (6) 合成 Second-strand cDNA ; (7) 体外转录合成cRNA ; (8) cRNA反转录； (9) 荧光标记后进行基因芯片杂交，最后进行数据分析。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)中采用差速贴壁法对所制 备的RMMVECs进行纯化。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)中充分裂解的方法为：将 RMMVECs用37°C预热的PBS清洗3遍，加入2ml Trizol溶液，静置5min，用移液枪吹打，使 RMMVECs充分裂解，转入离心管，于-80°C冰箱保存待用； 提取总RNA的方法为：将于-80 °C冰箱保存的溶于Trizol液中的细胞样品解冻， UOOOrpnufC离心5min，弃沉淀，将上清转入一新的离心管内；按Trizol :氯仿为5 :1的体 积量加入氯仿，剧烈振荡混勻至粉牛奶状，室温静置3min，12000rpm，4°C离心15min，取上 清至一新离心管，加入等体积异丙醇，混勻，室温静置5min，12000rpm，4°C离心15min，可见 白色RNA沉淀；弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇lml，使沉淀悬浮于乙醇中，7500rpm， 4°C离心15min ;弃去上清，再加入75%乙醇lml，重复上步；而后吸去所有上清，待残余乙醇 挥发尽后加入50 μ 1 DEPC水溶解RNA沉淀，-20°C冷冻保存。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（5)中反转录合成 First-strand cDNA的方法步骤为： A.取总RNA500ng，调整体积到4 μ L ; Β.加入基因表达谱外参1 μ 1 ; C. 配制反转录 Master Mix，其中 First Strand Buffer Mix4 μ L，First Strand Enzyme Mixl μ L，轻轻混勻，短暂离心置于冰上；取配好的5yL Master Mix分别转移至含 有总RNA样品的0. 2mL离心管中； D. 轻轻混匀溶液，瞬时离心后42°C反应2小时；将PCR仪的热盖温度也设置成42°C， 避免溶液蒸到管壁上；反应完后冰浴5分钟。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（6)中合成Second-strand cDNA的方法步骤为： A. 配制 Second-strand Master Mix，其中 Nyclease-free Waterl3 μ L， Second-strand Buffer Mix5 μ L，Second-strand Enzyme Mix2 μ L，轻轻混勻，短暂离心后 冰浴；取上步反应完毕的样品管中加入配好的20 μ L Second Strand Master Mix ; B. 轻轻混匀，16°C反应1小时，65°C lOmin ; C.反应结束后将反应物置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于-20°c。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（7)中体外转录合成cRNA的方 法步骤为： A. cRNA 合成：配制体外转录Master Mix，其中 Nyclease-free Water4yL，T7Byffer Mix20yL，T7Enzyme Mix6L，轻轻混勻，短暂离心，往上一反应中准备好的样品管中加入 30 μ L Master Mix ； B. 轻柔混匀，40°C反应16. 5小时； C. 反应完成后，准备纯化cRNA ; D...

【专利技术属性】
技术研发人员：董虹，胡格，张涛，段慧琴，姜代勋，穆祥，陈武，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京;11