本发明专利技术公开了一种检测肺癌骨转移荧光定量PCR的试剂盒。该试剂盒包括以下成分：特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。本发明专利技术还公开了一种检测肺癌骨转移荧光定量PCR试剂盒的使用方法。利用该试剂盒可以快速定量检测novel_mir_54的表达量，从而检测肺癌骨转移的发生情况。本发明专利技术操作简便、快速、结果稳定、灵敏度高且特异性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及小RNA检测试剂盒的制备及使用方法，具体而言，本专利技术涉及以新发现小RNA前体的核苷酸序列为基础，设计特异的寡聚核苷酸引物和荧光标记探针，采用实时荧光定量PCR技术组装肺癌骨转移的检测试剂盒，本专利技术也涉及其检测方法。
技术介绍
肺癌是当今世界上肿瘤患者死亡的首位病种，且其发病率和死亡率呈上升趋势，严重威胁着人类健康和生命。2000年全世界肺癌新发病例120万，死亡110万。造成肺癌高病死率的主要原因是早期肺癌因无症状而发现困难，当出现症状就诊时，大多已经比较严重或已肺外转移，到了临床不可治愈的阶段。肺癌易发生骨转移，有研究表明肺癌骨转 移发生率为 22% -81. 8%。(Lack E, Dickgreber N, Muller T, et al. Randomized PhaseIII study of Gemcitabine and Vinorelbine versus Gemcitabine， Vinorelbine， andCisplatin in the treatment of Advanced Non-Small-Cell lung cancer From theGerman and Swiss Lung Cancer Study Group. Journal of clinical Oncology，2004，22(12) :2348-2356)骨转移的常见临床症状包括程度不等的疼痛、病理性骨折、脊髓受压以及危及生命的高I丐血症等，统称骨相关事件(Skeletal related events, SREs)。骨转移瘤所引起的疼痛等症状往往成为肺癌患者的最大痛苦，对患者造成严重的心理影响，是临床上降低肺癌患者生活质量和影响患者生存的重要因素。肿瘤的浸润和转移是决定肿瘤患者预后的一个关键因素。大部分患者并不是死于原发部位的肿瘤，而是死于肿瘤其它部位的扩散转移。所谓肿瘤的转移，是指肿瘤细胞从原发肿瘤部位脱离，迁徙到其他位点，不断生长，最终发展为转移性肿瘤。人们很早就发现，肿瘤的转移不是随机性的，而是有选择性，具有嗜器官性的。肿瘤骨转移，是肿瘤转移研究中最早观察到的现象之一。骨骼的主要组成是矿物质成分，其微环境对肿瘤细胞而言可谓严酷，但乳腺癌、前列腺癌、肺癌却极易发生骨转移，这暗示能够转移至骨的肿瘤细胞具有改造局部微环境的特性。肿瘤骨转移过程涉及一系列复杂的分子事件，是多步骤、多因素、多基因共同参与的复杂过程，肿瘤细胞首先从原发灶中分离，通过侵袭透过肿瘤新生血管进入全身循环系统，在其中绝大多数癌细胞由于宿主免疫反应和血流物理压力而灭亡，只有极少量癌细胞可以存活，进入骨髓腔的窦状小管，而后穿过窦状小管的壁，侵袭骨髓基质，癌细胞与局部骨组织微环境发生一系列复杂的相互作用，导致癌细胞增殖分化，局部骨质破坏，形成骨转移灶。肺癌骨转移绝大多数为溶骨性转移，最初人们认为肿瘤骨转移引起溶骨性骨质破坏是肿瘤细胞直接作用引起的，然而研究证实到达局部骨组织的肿瘤细胞，并不能直接破坏骨组织，而是通过分泌多种细胞因子，包括甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、IL-U IL-6、前列腺素E2等，直接或间接的作用于骨组织中破骨细胞，激活破骨细胞引起局部骨吸收作用异常活跃，使局部出现溶骨性的骨质破坏，为肿瘤细胞的“定居”和扩展提供了空间。同时骨基质中富含有多种生长因子，包括转化生长因子(TGF-β)、纤维母细胞生长因子(FGF)、胰岛素生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(TOGF)和骨形态发生蛋白(BMP)等。溶骨性骨破坏的过程中，大量生长因子获得释放并被激活，刺激肿瘤细胞分裂增殖，同时增多的肿瘤细胞进一步刺激破骨细胞分化，骨质破坏进一步加重，这样就形成了一个恶性循环，从而导致溶骨性转移灶的形成。microRNA(miRNA)是天然存在、长约22个核苷酸的非编码RNA，它们介导了转录后的基因调控。miRNAs在许多生物过程中扮演了重要角色，包括分化和发育、细胞信号通路以及对感染的反应。miRNAs表现出一种转录后调控基因表达的全新机制，它通过结合靶基因的mRNA的3’ UTR抑制基因的表达。miRNAs已经被证实在发育、感染、免疫应答、炎症反应和肿瘤的发生等多种生理与病理过程中发挥作用。从最初发现到现在，已经在哺乳动物中发现了 700多个miRNAs，其中绝大部分miRNAs的生物学功能是未知的。已有报道，miRNAs参与免疫应答中多方面的调控作用。研究还发现血清和血浆中可以检测到循环miRNAs，且它们的表达因疾病而异，这一发现说明循环miRNAs的表达特征可作为疾病诊断和预防的 生物标志物，具有巨大潜力。而缺乏特异的、高敏感度的分子标志物是目前制约肺癌骨转移早期诊断以及有效治疗的关键问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测小RNA表达水平的荧光定量PCR试剂盒及使用方法，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。本专利技术的另一目的是在于提供一种荧光定量PCR试剂盒对肺癌是否发生骨转移进行快速的检测。为了实现上述目的，本专利技术首先分别提取了肺癌发生骨转移患者肿瘤细胞和肺癌未发生骨转移患者肿瘤细胞的总RNA,并从中纯化miRNA,利用Single-end library建库方法，共得到两个肺癌骨转移前后肿瘤细胞miRNA转录组文库。对所得的miRNA转录组文库进行高通量测序，对高通量测序序列过滤，去除低质量序列，使用S0AP2方法跟人类基因组进行比对。并对测序结果进行分析，其中通过fold-change方法，对不同样本的表达差异基因进行了比较，得到了表达差异显著的miRNAnovel_mir_54，其序列见SEQ NO. 5。本专利技术根据nOVel_mir_54的序列信息，设计了四条引物，第一条为茎环状结构的反转录引物RT54，其序列见序列表SEQ NO. I ;第二条是上游的特异引物F54，其序列见序列表SEQ NO. 2 ;第三条为下游的通用引物R54，其序列见序列表SEQ NO. 3 ;第四条是在荧光定量PCR中需要的荧光探针引物Flu54，其序列见序列表SEQ NO. 4，在荧光探针Flu54的5’端标有荧光基因FAM，在荧光探针Flu54的3’端标有荧光淬灭基团TAMRA。本专利技术还制备了含有noVel_mir_54序列的标准DNA模板。制备步骤方法如下使用TRNzol试剂抽提肺癌骨转移前肿瘤细胞的RNA，接着进行逆转录反应，反转录体系为茎环状结构的反转录引物RT54，SEQ ID NO. I (2 μ mol/L) I μ 1，细胞总RNA4 μ 1，dNTP混合物(每种 2. Smmol /I,) 4 μ 1,0. lmol/L DTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆转录酶(200U/μ I) 2 μ I。反应条件为37°C水浴60分钟，95°C水浴3分钟。将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR扩增，PCR产物检测后切胶回收并纯化，将纯化产物连接到PGM-T克隆载体上，随后转化到DH5a感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种novel_mir_54的反转录引物，其特征在于，所述的反转录引物其核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨祚璋，谢琳，徐磊，李国奇，
申请(专利权)人：杨祚璋，
类型：发明
国别省市：
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