一种高效扩增间充质干细胞的新方法技术

本发明专利技术属于生物医学领域，公开了一种高效扩增间充质干细胞的新方法。在体外扩增中，通过向间充质干细胞培养基中添加低剂量的组蛋白去乙酰化抑制剂，可以有效地提高间充质干细胞的体外扩增，并保持其自身的自我更新能力。为临床疾病治疗提供足够数量的间充质干细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一类促使间充质干细胞体外大量增殖的新方法及应用。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种具有自我更新和迁徙能力的多能成体干细胞，能够分化形成多种组织细胞并释放有益于组织再生修复的细胞活性因子，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。因其没有伦理学的约束，并且可以分化成具有相关功能的细胞或组织，从而成为实验和临床研究的重点。MSCs来源于多种组织，包括骨髓、脐带血、外周血、脂肪等，但无论哪一种来源，其取材数量都是有限的，很难满足临床移植所需的细胞数量要求。虽然MSCs在临床治疗上的前景和地位已经明确，但由于人体内干细胞来源数量有限，仅靠传统培养的方法难以在短时间内满足临床移植上对细胞数量的要求。因此，MSCs的体外扩增方法的探索一直是干细胞研究领域的热点问题。国内外已竟相开展这方面研究工作，取得了一些进展。目前，Chen等利用旋转式生物反应器扩增人骨髓MSCs，另外添加干细胞因子(Stem ce 11 factor, SFC)、白细胞介素-3 (Interleukin-3, IL-3)和 IL-6,检测发现Stro-l+Q)44+a)34-的MSCs在8d后可扩增9倍,成纤维细胞集落形成率(Colony-formingefficiency-fibroblast per day, CFE-F/day)是未用生物反应器扩增的对照组的I. 44倍，扩增后的细胞可表达间充质干细胞早期标志波形蛋白(Vimentin)和Endoglin(SH2),而分化细胞的标志如II型胶原、骨钙素(Osteocalcin，Oc)和C/EBP-α等则未检测到，并且这些细胞可分化为成骨细胞、成软骨细胞及成脂肪细胞。Yu等也利用生物反应器成功在体外扩增出MSCs，如利用搅拌式生物反应器培养人胎盘来源的MSCs，与用培养皿扩增的对照组细胞相比较，培养144h后搅拌式生物反应器扩增的细胞数量是培养皿的I. 73倍，并且MSCs的表型特征不变。通过气升式环流中空纤维膜生物反应器对兔骨髓MSCs进行三维动态培养，7d后可扩增16倍，扩增后大部分细胞呈CD29+、CD44+、CD45-，保持MSCs的表型，并具有较强的成骨、成软骨和成脂的多向分化能力。这些研究表明，通过生物反应器不但可使MSCs在数量上得到扩增，还能够保证MSCs维持原本的表型和分化能力，符合临床移植用MSCs的基本生物学特征。除了生物反应器，科学家们还发现了其他方法也有助于实现MSCs体外扩增。研究发现通过表面抗原筛选可以提高MSCs扩增效率。一般认为间充质干细胞的表面抗原情况与造血干细胞相反，即 CD31、CD34 为阴性，CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD106、CD271 等为阳性。根据这一特性，Jarocha等通过免疫磁珠分离纯化CD105+CD271+的人骨髓MSCs并扩增，表达CD105和CD271的成纤维细胞集落生成单位(Colony-forming unitfibroblastic,CFU-F)是未纯化细胞的3-4倍。此外，其他一些影响MSCs体外扩增的因素也陆续被报道。有研究者通过改善培养基质实现MSCs的体外扩增，Zangi等用纤维蛋白微珠可有效将MSCs从大鼠骨髓中分离并且扩增。Kocaoemer等用人AB血清和凝血酶激活的富含血小板血衆(Thrombin-activated platelet-rich plasma)分别作为扩增用血清,对人脂肪来源的MSCs进行扩增，结果表明第6代MSCs的扩增倍数分别为66. 6± 15. 7和68. I ±6. 7，而用胎牛血清扩增的倍数仅为24. 4±0. 7。除基质材料与血清的优化外，一些生长因子也有利于MSCs的扩增。如Tamama等证实表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor,EGF)可通过使ERK及AKT磷酸化的途径刺激人骨髓MSCs增殖，Farre等报道成纤维细胞生长因子-4 (Fibroblast growth factor-4, FGF-4)可使MSCs的复制周期显著缩短且不改变其多向分化潜能。最近，Zscharnack等还发现氧浓度也可影响MSCs的扩增,他们通过比较5%和20%的氧气浓度下MSCs的扩增，发现5%的氧浓度下MSCs形成的CFU-F比20%的氧气浓度多2倍，并且老化程度也比20%的氧气浓度轻。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在针对MSCs体外大量扩增，以及在扩增时出现自主分化和伴随的衰老及迁徙能力减退等问题，提供一种利用低剂量组蛋白去乙酰化抑制剂解决MSCs体外大量扩增的新方法。为了实现上述目的，本专利技术公布了一种通过向MSCs培养基中添加低剂量组蛋白去乙酰化抑制剂(Largazole，TSA)，经过7天培养，可使MSCs体外增殖21倍，并保持其自我更新能力。为临床疾病治疗提供足够数量的间充质干细胞。本专利技术涉及MSCs增殖的方法，包含将适量的小分子化合物添加到MSCs的培养基中。如上所述的添加物，其化合物类型是组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)。研究发现，低剂量的去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A(TSA)能使神经干细胞重新表达0ct4等干性相关转录因子，并使这些细胞额外获得了形成造血细胞的能力。低浓度去乙酰化酶抑制剂VPA(150yg/mL)可以提高造血干细胞的自我更新和增殖能力。用组蛋白乙酰化抑制剂anacardic acid(AA)的细胞治疗法，可避免由c_MYC、PcG和pl6INK4A基因引起的复制性衰老，使干细胞保持较强的自我更新能力。从而推测干细胞分化和相关基因核心蛋白乙酰化程度有着重要的联系。如上所述的添加物，其是组蛋白去乙酰化抑制剂中的Largazole、TSA、VPA、NaBu等将其应用于MSCs的培养基中。如上所述的添加物，其组蛋白去乙酰化抑制剂Largazole或TSA在培养基中的浓度范围是lpM/ml 10nM/ml之间。如上述所述的MSCs，其特征是优先选取人成体MSCs ；如上述所述的MSCs，其特征是优先选取成体骨髓MSCs ；如上述所述的MSCs，其特征是优先选取人胎盘MSCs ；如上述所述的MSCs，其特征是优先选取人脂肪MSCs ；如上述所述的MSCs，其特征是优先选取人脐带间充质干细胞。根据人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的生物学特性，细胞衰老分为三个阶段早期(10代以内)，中期(10-15代)，晚期(16代以后)细胞到晚期后，各种生物学特性发生明显变化，多能性基因表达量下降，衰老分化基因明显增加。附图说明图I是实施方法一中评价不同浓度的Largazole对细胞增殖能力的影响图。图2是实施方法一中评价不同浓度的TSA对细胞增殖能力的影响图。图3是实施方法一中进一步验证上面两种药物的最佳浓度图。图4是实施方案二中CCK8法测定P16的各组细胞生长曲线图。图5是实施方案三中评价不同培养条件对细胞增殖的影响图。图6是实施方案四中MSCs经HDACi处理后4代相关基因表达的变化图。图7是实施方案四中MSCs经HDACi处理后16代相关基因表达的变化图。具体实施例方式实施方法一.不同药物浓度作用本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术公布了一种高效扩增间充质干细胞(MSCs)的新方法，将适量的小分子化合物添加到MSCs的培养基中，从而使MSCs高效扩增。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李富荣，齐晖，王云帅，邓春艳，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，
类型：发明
国别省市：