本发明专利技术公开了一种鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP及鸭瘟病毒gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP，含所述转移载体pUC-ΔgC-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia?coli)DH5α于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC?NO：M2011432。该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，挑斑纯化后获得EGFP标记的重组病毒DPV-ΔgC-EGFP。实验结果表明，三种剂量重组病毒DPV-ΔgC-EGFP和弱毒疫苗一样能够给强毒攻击后的雏鸭提供100％保护，揭示其有望发展成为一种有效预防鸭瘟病的新型疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术制药エ业中的基因工程领域，特别是涉及ー种鸭瘟病毒转移载体及其应用。
技术介绍
利用基因工程技木，将外源DNA转移到相应载体中，通过和病毒基因重组，可以使病毒基因功能丧失，或者表达外源蛋白。通过这种方式，一方面，可以更清楚地了解缺失基因的功能，另ー方面，利用病毒表达外源DNA蛋白，可将病毒发展成为ー种活载体疫苗。病毒活载体疫苗的转染效率高，表达的保护性外源蛋白接近翻译后水平的成熟蛋白；这种疫 苗可同时启动机体细胞和体液免疫，可通过一次免疫预防多种疾病，疫苗用量少，既降低了生产成本，又简化了免疫程序，还能克服不同病毒弱毒疫苗间的干扰现象，因此，病毒活载体疫苗成为了疫苗研究的ー个重要方向。随着分子生物学的发展，对ー些基因组较大病毒的分子位点和结构的认识逐渐清晰，从而将它们发展成为有效的重组病毒活疫苗。在禽病疫苗研究中，鸡痘病毒，腺病毒及包括火鸡疱疫病毒、鸡传染性喉气管炎和鸡马立克氏病病毒在内的疱疫病毒。其中，禽疱疫病毒具有宿主范围窄、外源基因容量大，病毒滴度高的特点，随着对它们基因组的了解，近年来被广泛研究。我国是世界最大的鸭、鹅等水禽生产和消费国，以龙头企业为代表的规模化养殖在不断发展，但是，传染病的危害仍然是影响水禽养殖业健康、可持续发展的重要因素，因此，亟待加强对水禽传染病的防治。鸭瘟是由鸭瘟病毒引起鸭、鹅及多种雁形目水禽的急性接触性传染病，1923年由Baudet首次在荷兰报道该病，之后在法国、美国、印度、比利时、英国、泰国、加拿大等国家流行。我国于1957年首次发现并报道，随后在华南、华中和华东等养鸭业较发达的地方发生流行，给养鸭业造成巨大的经济损失。在我国，鸭瘟曾被列为ー类动物传染病，目前仍被列为ニ类动物传染病。目前，鸭瘟病毒的基因组结构已经比较清楚。NCBI上登录了鸭瘟病毒强毒株CHv (登录号JQ647509)、欧洲株2085 (登录号JF999965)和疫苗株VAC株(登录号:NC_013036)全基因组，疫苗株Clone-03所有的ORF也已经全部上传。鸭瘟病毒的基因组为158-160kb的线状、双链DNA，基因组类型为D型，由UL和US及US两侧的重复区域IRS和TRS组成，共包括78个编码基因。与其他疱疹病毒一祥，基因组庞大的鸭瘟病毒，也可以发展成为有效的病毒活载体疫苗。鸭瘟病毒的感染宿主为鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽，因此，鸭瘟病毒载体对其他动物和人类是安全的，但可以在防治水禽相关疾病中发挥重要作用。糖蛋白既是动物机体免疫系统识别的成分，也是病毒感染时细胞与病毒相互作用的重要因子，其基因结构和功能一直是疱疹病毒研究的热点之一。鸭瘟病毒可编码12种糖蛋白，即gB、gC、gD、gE、gG、gH、gl、gj、gK、gL、gM和gN。在其它疱疫病毒,体外复制非必需的糖蛋白gC、gE、gG、gl和gM常常被用作外源基因的插入位点。但是，鸭瘟病毒的相关研究仍处于起步阶段，各种糖蛋白的功能仍待进ー步研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于1)提供ー种重组鸭瘟病毒的转移载体及其构建方法；2)研究开发我国适于水禽免疫的可复制性病毒活载体，研制相关基因工程疫苗，以期在控制水禽重要传染病方面发挥作用，3)为鸭瘟病毒基因功能研究提供參考。鸭瘟病毒转移载体pUC- Δ gC-EGFP，含所述转移载体pUC_ Δ gC-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)DH5 α于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO :Μ2011432。所述的转移载体PUC- Δ gC-EGFP的制备方法，由以下步骤完成 I)用Xho I和BamH I双酶切pEGFP_Cl，末端补平后，平末端连结，再通过PCR方法扩增出包含CMV启动子、EGFP和SV40poIyA的片段共1315bp片段，克隆进载体pMD19_T，构建pMD-EGFP，其中含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒；2)以鸭瘟病毒CHv株为材料，通过PCR方法将UL44基因的左端1178bp片段和右侧1421bp片段扩增出来，克隆进载体PMD19-T，构建质粒pMD-gCL和pMD-gCR，分别包含UL44基因的左侧1178bp片段和右侧142Ibp片段。3)先将pMD-gCL用Hind III和Xba I酶切，回收1178bp片段，克隆进已用相应酶酶切的PUC19载体，然后再将pMD-gCR中的UL44右侧片段以BamH I和EcoR I插入到已含有UL44左侧片段的pUC-gCL载体中，获得载体pUC-Λ gC，在该载体的Xba I和BamHI之间连接含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒，获得含有报告基因的转移载体pUC-ΛgC-EGFP。上述扩增UL44基因的左侧1178bp片段的上、下游引物分别是gCLF 5' -TTGCCCAAGCTTGGGACAAGAACGGAGGTCAAGAC-3'gCLR 5' -CTAGCTCTAGAGCGATATAGAATCGTTAAGTATT-3'上述扩增UL44基因的右侧1421bp片段的上、下游引物分别是gCRF 5' -ATACGGGATCCCGTGGCCGTTTGTTTCTATTAT-3'gCRR 5' -ATCGGAATTCCATACACGGATTAGCCAGA-3'上述扩增EGFP 1315bp片段的上、下游引物分别是 GFPF 5' _TACCGGGATCCCGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACG_3'GFPR 5/ -AACGCTCTAGAGCATGCAGTGAAAAAAATGCT-3'。鸭瘟病毒gC缺失重组株DPV-Λ gC-EGFP，其于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO :V201137。所述鸭瘟病毒gC缺失重组株DPV- Δ gC-EGFP的制备方法，由以下步骤完成I)鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞；2)所述的转移载体pUC- Δ gC-EGFP转染；3)收获出现荧光的细胞，反复冻融后接种鸭胚成纤维细胞；4)将出现荧光的细胞覆盖营养琼脂；5)挑出含荧光斑细胞，反复冻融；6)将反复冻融后的含荧光斑细胞按不同浓度稀释后接种鸭胚成纤维细胞，孵育2h后，吸去上清，覆盖营养琼脂；7)重复步骤5)和步骤6)至获得纯化的含EGFP基因的重组鸭瘟病毒DPV-ΛgC-EGFP。采用上述方案，本专利技术通过。附图说明图IA为含CMV启动子、EGFP、SV40polyA的T克隆质粒pMD-EGFP结构示意图；B为转移载体PUC- Δ gC-EGFP结构示意图。图2UL44左右臂扩增引物位置示意图。 图3鸭瘟病毒重组株DPV- Δ gC-EGFP 一步生长曲线。图4A为第一代重组病毒形成的荧光斑；B为第二代重组病毒形成的荧光斑；C为经过连续十五代纯化后形成的均一荧光斑。图5中A、B、C分别为重组病毒DPV- Δ gC-EGFP在可见光显微镜下、荧光显微镜下及合成图片，D、E、F分别为鸭瘟病毒亲本株DPV CHv在可见光显微镜下、荧光显微镜下及合成图片。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。含转移载体pUC-Δ g本文档来自技高网...
【技术保护点】
鸭瘟病毒转移载体pUC？ΔgC？EGFP，含所述转移载体pUC？ΔgC？EGFP的大肠杆菌种(Escherichia？coli)DH5α于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC？NO：M2011432。
【技术特征摘要】
1.鸭瘟病毒转移载体pUC-A gC-EGFP，含所述转移载体PUC- A gC-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)DH5a于2011年11月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO :M2011432。2.权利要求I所述的转移载体pUC-A gC-EGFP的制备方法，其特征在于由以下步骤完成 1)用XhoI和BamH I双酶切pEGFP-Cl，末端补平后，平末端连结，再通过PCR方法扩增出包含CMV启动子、EGFP和SV40polyA的片段共1315bp片段，克隆进载体pMD19_T，构建pMD-EGFP，其中含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒； 2)以鸭瘟病毒CHv株为材料，通过PCR方法将UL44基因的左端1178bp片段和右侧1421bp片段扩增出来，克隆进载体PMD19-T，构建质粒pMD-gCL和pMD-gCR，分别包含UL44基因的左侧1178bp片段和右侧142Ibp片段。 3)先将pMD-gCL用HindIII和Xba I酶切，回收1178bp片段，克隆进已用相应酶酶切的PUC19载体，然后再将pMD-gCR中的UL44右侧片段以BamH I和EcoR I插入到已含有UL44左侧片段的pUC-gCL载体中，获得载体pUC- A gC，在该载体的Xba I和BamH I之间连接含CMV启动子和SV40polyA的EGFP表达盒，获得含有报告基因的转移载体pUC- A gC-EGFP。上述扩增UL44基因的左侧1178bp片段的上、下游引物分别是 gCLF 5'...
【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，孙昆峰，汪铭书，陈孝跃，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。