本发明专利技术公开了鉴定Monilia?polystroma的方法及其专用引物。本发明专利技术所提供的用于鉴定M.polystroma的引物对，由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物组成。本发明专利技术提供的引物和方法能快速、准确鉴定M.polystroma。已经对4种仁果及核果褐腐病菌即Monilinia?fructicola、Monilinia?fructigena、Monilinia?laxa、M.polystroma及其近似种进行了验证，结果显示该引物具有很强的特异性。应用本发明专利技术，提取褐腐病菌的DNA作为模板进行PCR扩增，用常规的琼脂糖凝胶电泳，整个过程可在5小时内完成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鉴定Monilia polystroma的方法及其专用引物。
技术介绍
褐腐病(Brown Rot)是核果及仁果生产及贮藏期重要的病害。2001年，美国南部的乔治亚州褐腐病大面积发生，给桃产业带来直接经济损失达430万美元，购买杀菌剂带来间接经济损失为150万美元。在我国，一些地区发病率可达20 %，严重时发病率达100 %， 严重影响果实的食用价值和果农的经济收入。褐腐病主要是由子囊菌门(Ascomycete)，盘菌纲(Discomycete)，柔膜菌目 (Helotiales)，核盘菌科(Sclerotiniaceae)，链核盘菌属(Monilinia)的三种病原菌---Monilinia fructicola、M. fructigena、M. Iaxa 所弓|起的。2002 年，van Leewen 根据形态特征及ITS序列差异将来自日本的M. fructigena菌株区分出来，命名为Monilia Polystroma0M. polystroma主要发生在日本，但目前已经报道从匈牙利和我国发现了该菌。 因此，Mpolystroma是重要的检疫对象。M. polystroma主要侵染苹果等仁果类植物及其果实，在我国报道的菌株来自与日本毗邻的黑龙江省，并且该菌分离自核果类的李子，至于该菌在不同寄主及地区的发生和分布情况仍不清楚，M. polystroma的危害性还有待深入研究。苹果是我国重要的进出口果品，随着各国果品贸易的不断加强，M. polystroma传播扩散的风险不断加大。因此应当加强对Mpolystroma的检疫工作。四种褐腐病菌的的形态特征非常相似，缺少经验时很难准确判断。近年发展起来的分子生物学技术也在褐腐病菌的种类鉴定中得到了广泛应用。针对M. polystroma的分子检测中，Cote (2004) (Cote, 2004, Mycologia，96 =240-248)根据随机引物多态性设计了鉴定M. polystroma的引物，但是当我们用这些引物进行测试时，发现它们往往不能正常工作(樊锦燕等，2007)(樊锦燕等，2007，植物保护学报，34:289-295)。截至目前，没有可用于准确鉴定Monilia polystroma的分子方法。因此，应当针对来自世界多个国家和地区的褐腐病菌，开发具有稳定特异性用于鉴定Monilia polystroma的引物，建立准确的分子鉴定方法，为国际贸易中苹果等果品的快速通关提供有力的技术支持。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于鉴定和/或辅助鉴定Monilia polystroma的引物对。本专利技术所提供的用于鉴定和/或辅助鉴定Monilia polystroma的引物对，由序列表中序列1所示的DNA片段和序列表中序列2所示的DNA片段组成。本专利技术的另一个目的是提供一种鉴定和/或辅助鉴定Monilia polystroma的方法。本专利技术所提供的鉴定和/或辅助鉴定Monilia polystroma的方法，包括以下步骤3以待鉴定真菌菌株的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物为750bp的片段，则确定所述待鉴定真菌菌株为和/或候选为Monilia polystroma。所述检测所述PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物在凝胶上显示为700bp-800bp的条带，则确定所述待鉴定真菌菌株为和 / 或候选为 Monilia polystroma。 所述检测所述PCR扩增产物的方法为测序检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物为750bp的片段，则确定所述待鉴定真菌菌株为和/或候选为Monilia polystroma。本专利技术的又一个目的是提供一种鉴定和/或辅助鉴定褐腐病致病菌的方法。本专利技术所提供的鉴定和/或辅助鉴定褐腐病致病菌的方法，包括以下步骤从发生褐腐病的植物组织中分离得到待鉴定真菌菌株，以待鉴定真菌菌株的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR 扩增产物，若所述PCR扩增产物为750bp的片段，则确定所述褐腐病的致病菌包含和/或候选包含 Monilia polystroma。所述检测所述PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物在凝胶上显示为700bp-800bp的条带，则确定所述褐腐病的致病菌候包含和/或侯选包含Monilia polystroma。所述检测所述PCR扩增产物的方法为测序检测所述PCR扩增产物，若所述PCR 扩增产物为750bp的片段，则确定所述褐腐病的致病菌包含和/或候选包含Monilia polystroma。本专利技术的又一个目的是提供一种鉴定和/或辅助鉴定Monilia polystroma的试剂盒。本专利技术所提供的鉴定和/或辅助鉴定Monilia polystroma的试剂盒，含有由序列表中序列1所示的DNA片段和序列表中序列2所示的DNA片段组成的引物对。本专利技术的又一个目的是提供一种鉴定和/或辅助鉴定褐腐病致病菌的试剂盒。本专利技术所提供的鉴定和/或辅助鉴定褐腐病致病菌的试剂盒，含有由序列表中序列1所示的DNA片段和序列表中序列2所示的DNA片段组成的引物对。所述引物对或所述试剂盒在鉴定和/或辅助鉴定Monilia polystroma或褐腐病致病菌中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供的引物和方法能快速、准确鉴定Monilia polystroma。本专利技术的鉴定方法是利用核果及仁果上褐腐病菌的漆酶基因lcc2具有种内保守、种间变异的特点， 根据序列差异较大的区段设计引物进行鉴定。已经对来自中国、美国、法国、新西兰、英国、意大利、日本等多个国家已知的4种仁果及核果褐腐病菌即Monilinia fructicola, M. fructigena.M. laxa.M. polystroma及其近似种进行了验证，结果显示该引物具有很强的特异性。应用本专利技术，提取褐腐病菌的DNA作为模板进行PCR扩增，用常规的琼脂糖凝胶电泳，整个过程可在5小时内完成。附图说明图1为褐腐病菌Monilia polystroma的特异性PCR扩增产物的电泳图谱。4图2为应用本专利技术的特异性引物检测褐腐病致病菌的PCR扩增产物的电泳图谱。 具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、用特异性引物鉴定Monilia polystroma选用菌株美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)(购自荷兰菌种保藏中心 CBS167. 24, http//www. cbs. knaw. nl/)、核果褐腐病菌(Monilinia laxa)(购自荷兰菌种保藏中心 CBS489. 50，http//www. cbs. knaw. nl/)、仁果褐腐病菌(Monilinia fructigena)(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是I00S&Frey， 2000, Euro本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于鉴定和／或辅助鉴定Ｍｏｎｉｌｉａ ｐｏｌｙｓｔｒｏｍａ的引物对，由序列表中序列１所示的ＤＮＡ片段和序列表中序列２所示的ＤＮＡ片段组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱小琼，国立耘，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。