利用慢病毒载体介导RNAi的方法技术

本发明专利技术是一种利用慢病毒载体介导RNAi的方法，具体是：先对相关病毒的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相关病毒保守区域的siRNA；将siRNA克隆到表达质粒pLVTH后，再与pCMV-dR8.91、pMD2.G共同转染293T细胞中，收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达siRNA的高滴度的慢病毒载体，然后将其与LV-tTR-KRAB共转导入靶细胞，并且利用四环素类似物DOX来严格控制siRNA药物作用的时间及剂量。本发明专利技术因其高效的转导率及严格的控制体系可以真实的评价siRNA在体内的抗病毒作用，同时可以追踪药物干扰作用的全过程，从而为临床提供了使用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物信息学及分子病毒学
，具体涉及一种基于强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi研究抗病毒的方法。
技术介绍
近年来世界上很多实验室利用SiRNA干扰进行抗病毒研究，很多结果要么互相矛盾要么干扰效果不明显。关键的问题是，他们所使用的工作模型大都仅限于使用转染的细胞系。由于转染效率极其有限，难以对进入胞内的siRNA抗病毒效果真正进行评价。后来， RNAi常常利用病毒载体来表达siRNA，其中常见的是逆转录病毒载体和腺病毒载体。但是逆转录病毒只感染分裂期细胞，容纳外源基因的DNA片段不超过81Λ ；腺病毒载体感染细胞时，病毒DNA游离在细胞核内，并不能整合到宿主染色体中，在体内不能实现稳定的长期表达，而且反复应用容易引起免疫反应，所以来源于人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-I)的慢病毒载体(Lentiviral vector)越来越受到人们的重视。慢病毒载体既可以感染分裂细胞，也可以感染非分裂细胞如神经细胞、肝细胞、造血干细胞以及肌肉细胞等，转移的外源基因片段大，宿主范围很广，而且降低了重组的机会，最重要的特点是它可以整合到宿主的基因组中，从而可以高效持久的表达外源基因，因而成为广为关注的真核生物基因转移的载体。经修饰过后的慢病毒载体在真核细胞中可以实现诱导调控，比如在慢病毒载体上加入一个多重控制开关，通过四环素或四环素类似物就可以实现对外源基因的可控表达。慢病毒载体的构建非常简单，原理就是将HIV-I基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。目前构建慢病毒有二质粒表达系统、三质粒表达系统以及四质粒表达系统。最常用的是三质粒表达系统(包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒)包装质粒用来表达HIV-I复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒的包膜蛋白及辅助蛋白vpu ；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)；转移质粒中含有Hl启动子，能在宿主细胞中持续表达外源基因，同时表达由 EFl (Elongation i^ctorl)启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)，用于病毒包装时转染效率及感染目的细胞的感染效率的检测。三质粒表达系统的最大优势是使序列重叠的机会大大降低，从而降低了载体重组过程中产生RCV的可能性。拥有多重控制开关的慢病毒载体系统，能使转染效率大幅度提高到90%以上。为此，我们将利用该系统深入评价siRNA抗病毒的效果。由于极高的转染效率，将会使药物的抗病毒效果得到更真实的评价，将来也更有可能用于体内的特异靶向性药物释放。另外，该体系所拥有的四环素开关，不仅能使研究者详细调查siRNA药物的干扰效果，而且通过开关控制能够追踪药物干预的过程，为探索药物动力学、代谢学和毒理学提供了可能。因此， 建立该系统将为抗病毒药物研究提供一个极为实用的工具
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是运用强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi技术，提供一种利用siRNA研究抗病毒的方法，以便对siRNA药物的干扰作用进行详细评价， 而且通过开关控制来追踪药物作用的全过程，为抗病毒药物的研究作出贡献。本专利技术解决其技术问题采用以下的技术方案本专利技术提供的是一种基于强力霉素控制的慢病毒载体介导RNAi的方法，具体是 首先，运用相关的生物学软件对相关病毒的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相关病毒保守区域的siRNA ；再将合成的siRNA克隆到表达质粒pLVTH中，然后将该表达质粒与pCMV-dR8. 91、pMD2. G共同转染细胞中，收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达siRNA的高滴度的慢病毒载体，最后将表达siRNA的慢病毒载体与控制四环素开关的慢病毒载体LV-tTR-KRAB共转导入靶细胞，并且利用四环素类似物 DOX来严格控制siRNA药物作用的时间及剂量。本专利技术可以采用包括以下步骤的方法(1)筛选 siRNAs:先根据GeneBank中HBV的基因序列U95551，参考siRNA设计的原则，在shRNA设计网立占 http//rnadesigner. classic, invitrogen. com/rnaiexpress/index, jsp 选择基因编码区AA开头的长度为21nt、GC%在45% -55%之间的保守核苷酸序列，避开5’和3’ 端的非编码区，再将选择的序列进行BLAST同源分析，避开与人基因组存在同源的干扰序列。(2)对筛选出的siRNAs的评价将不同的siRNAs构建到真核表达载体pSuper中，初步评价这几种siRNAs对病毒是否有影响，其方法是利用LipofectamindOOO (购自美国^witrogen公司)将 pSuper-shRNA转染进细胞中，收集转染后细胞上清及细胞，利用分子生物学技术检测相应的病毒指标的变化；(3)构建表达shRNA的慢病毒载体分别将这几种shRNAs克隆到慢病毒转移质粒pLVTH中，然后将构建好的转移质粒pLVTH-HBV-shRNA与包装质粒pCMV_dr8. 91、包膜质粒pMD2. G按照每60mm细胞培养皿15yg IOyg 5 μ g的比例用磷酸钙转染试剂盒(购自碧云天公司)共转染进汇合率为80%左右的细胞中，收集转导后48h的细胞上清，2500rpm离心5-lOmin，将上清用0. 45 μ m滤膜过滤去除细胞碎片，然后M500rpm离心2hours，弃去上清，最后用 Opti-MEM(购自美国Gibco公司)重悬病毒；(4)测慢病毒载体的滴度将重悬病毒按照10倍梯度稀释，然后分别加入96孔板的各空中，至培养箱中培养；孵育过夜后，换新鲜的细胞培养液继续培养；4 后观察荧光，数出荧光细胞占9-11% 的孔中细胞的数目；再按照以下公式计算出病毒滴度Tilter (/ml) = 10% GFP+CellsX 总细胞数 X 病毒稀释倍数，(5)评价构建的慢病毒载体介导的RNAi对病毒的影响将构建好的慢病毒载体按照MOI = 10的滴度转导进靶细胞，转导可同时加入 6 μ g/mL的Polybrene (购自美国Sigma公司)以提高转导效率，然后详细评价转导后不同时间内病毒复制和表达水平的变化；5(6)构建强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi系统将表达四环素抑制蛋白tTR-KRAB的表达质粒与慢病毒包装质粒pCMV_dr8. 91、包膜质粒pMD2. G共转导进细胞中，收集4 后的细胞上清2500rpm离心5-lOmin，将上清用0. 45 μ m滤膜过滤，然后M500rpm离心^iours,弃去上清，最后用Opti-MEM重悬病毒， 使病毒的滴度与表达shRNA的慢病毒载体的滴度达到一致；(7)观察DOX诱导的慢病毒载体介导的RNAi对病毒复制和表达的影响将表达 shRNA的慢病毒与表达四环素调控蛋白tTR-KRAB的慢病毒同转导进靶细胞中，第二天将细胞分为2组，一组加DOX处理，另一组不加DOX处理，4天后分别收集这两组细胞，抽提细胞内的HBV的核衣壳，一半直接用来做Wfestern blotting，目的是检测HBV core蛋白表达水平的变化；另一半将核衣壳内的HBV DNA抽提纯化出来，用P”标记的探针做Southern blo本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种利用慢病毒载体介导ＲＮＡｉ的方法，其特征是一种基于强力霉素控制的慢病毒载体介导ＲＮＡｉ的方法，具体是：首先，运用相关的生物学软件对相关病毒的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相关病毒保守区域的ｓｉＲＮＡ；再将合成的ｓｉＲＮＡ克隆到表达质粒ｐＬＶＴＨ中，然后将该表达质粒与ｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１、ｐＭＤ２．Ｇ共同转染２９３Ｔ细胞中，收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达ｓｉＲＮＡ的高滴度的慢病毒载体，最后将表达ｓｉＲＮＡ的慢病毒载体与控制四环素开关的慢病毒载体ＬＶ－ｔＴＲ－ＫＲＡＢ共转导入靶细胞，并且利用四环素类似物ＤＯＸ来严格控制ｓｉＲＮＡ药物作用的时间及剂量。

【技术特征摘要】
1.一种利用慢病毒载体介导RNAi的方法，其特征是一种基于强力霉素控制的慢病毒载体介导RNAi的方法，具体是首先，运用相关的生物学软件对相关病毒的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相关病毒保守区域的siRNA ；再将合成的siRNA克隆到表达质粒PLVTH中，然后将该表达质粒与pCMV-dR8. 91、pMD2. G共同转染细胞中， 收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达siRNA的高滴度的慢病毒载体，最后将表达siRNA的慢病毒载体与控制四环素开关的慢病毒载体LV-tTR-KRAB共转导入靶细胞，并且利用四环素类似物DOX来严格控制siRNA药物作用的时间及剂量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用包括以下步骤的方法(1)筛选siRNAs 利用生物信息学筛选出针对相应病毒的几种siRNAs 先根据GeneBank中相关病毒的基因序列，参考siRNA设计的原则，在shRNA设计网站http//rnadesigner. classic, invitrogen. com/rnaiexpress/index. jsp 选择基因编码区 AA 开头的长度为 21nt、GC% 在 45%-55%之间的保守核苷酸序列，避开5’和3’端的非编码区，再将选择的序列进行BLAST 同源分析，避开与人基因组存在同源的干扰序列；(2)对筛选出的siRNAs的评价将不同的siRNAs构建到真核表达载体pSuper中，初步评价这几种siRNAs对病毒是否有影响，其方法是利用LipofectamindOOO 将pSuper-shRNA转染进细胞中，收集转染后细胞上清及细胞，利用分子生物学技术检测相应的病毒指标的变化；(3)构建表达shRNA的慢病毒载体分别将这几种shRNAs克隆到慢病毒转移质粒pLVTH中，然后将构建好的转移质粒 pLVTH-HBV-shRNA与包装质粒pCMV_dr8. 91、包膜质粒pMD2. G共转导进细胞中，收集转导后4 的细胞上清，2500rpm离心5_10min，将上清用0. 45 μ m滤膜过滤，然后M500rpm 离心2 hours，弃去上清，最后用Opti-MEM重悬病毒；(4)测慢病毒载体的滴度将重悬病毒按照10倍稀释，然后分别加入各孔中，至培养箱中培养；孵育过夜后，换新鲜的细胞培养液继续培养；4 后观察荧光，数出荧光细胞占9-11%的孔中细胞的数目；再按照以下公式计算出病毒滴度Tilter(/ml) = 10% GFP+ cellsX总细胞数X病毒稀释倍数，(5)评价构建的慢病毒载体介导的RNAi对病毒的影响将构建好的慢病毒载体按照MOI=IO的滴度转导进细胞，然后详细评价病毒复制和表达的水平；(6)构建强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi系统将表达四环素抑制蛋白tTR-KRAB的表达质粒与慢病毒包装质粒pCMV-dr8. 91、包膜质粒pMD2. G共转导进细胞中，收集4 后的细胞上清，2500rpm离心5_10min，将上清用 0. 45 μ m滤膜过滤，然后M500rpm离心2 hours,弃去上清，最后用Opti-MEM重悬病毒，使病毒的滴度与表达shRNA的慢病毒载体的滴度达到一致；(7)将表达shRNA的慢病毒与表达四环素调控蛋白tTR-KRAB的慢病毒同转导进靶细胞中，然后观察DOX加或者不加的情况下病毒复制和表达水平...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡康洪，王薇薇，彭洪泉，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：83