一种靶向LIN28基因的干扰小分子RNA及其抗胶质瘤增殖的用途制造技术

本发明专利技术涉及一种靶向LIN28基因干扰小分子RNA及其抗胶质瘤迁移的用途。该干扰小分子RNA为SEQNO.1所示的碱基序列。本发明专利技术设计对抑制胶质瘤增殖有作用的基因的干扰小分子RNA，应用胶质瘤细胞模型研究其对胶质瘤增殖的抑制作用，为胶质瘤的基因治疗提供了一种新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种靶向LIN^基因的干扰小分子RNA及其抗胶质瘤增殖的用途。
技术介绍
LiM8最早在线虫中发现控制发育时段的异常基因。大量的研究表明，LiM8和 Lin28B在发育和疾病领域有广泛而重要的作用。在人类纤维母细胞被诱导为多功能干细胞的过程中，LiM8是四个关联诱导因子之一，在诱导分化过程发挥调节作用，同时发现 Lin28和Lin28B的表达在多种癌中激活，他们的过表达常诱导细胞形状的改变。已有研究揭示在胚胎细胞生物学、细胞再分化、发育和癌症的探索过程中LiM8都具有重要的生物学作用。LiM8基因对肿瘤细胞的增殖方面的研究，在国内外尚未见诸报道。脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性脑肿瘤，起源于神经胶质细胞。由于恶性脑胶质瘤具有生长迅速，侵袭性强，手术后容易复发，病死率高等的特点，尽管包括手术切除术，放疗以及化疗在内的脑胶质瘤综合治疗水平在不断提高，但其总体疗效仍不理想。患上多形性胶质母细胞瘤(WHO IV级)的病人的平均存活时间仅仅为12-15个月，而患上间变性星形细胞瘤(WHO III级)的病人的平均存活时间为2-5年。因此，寻找有效的脑胶质瘤治疗方法仍是神经外科领域关注的焦点。LI拟8是一种高度保守的RNA结合蛋白 (RBP)，在线虫和高等物种中有着复杂的调节机制和表达方式，对微小RNA表达的调节、骨髂肌及心肌分化、肿瘤形成、多潜能诱导等多种发育的重要事件中起关键作用。近年来，多项研究显示，LIN28在多种肿瘤中起到关键的作用，并且有研究认为LI拟8可能是一种调节细胞生长和发育的重要的原癌基因。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA介导的细胞内与其序列同源的mRNA发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默机制。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种靶向LIN^基因干扰小分子RNA。本专利技术的目的之二在于提供该干扰小分子RNA的制备方法。本专利技术的目的之三在于提供该干扰小分子RNA的应用。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种用于抗胶质瘤增殖的干扰小分子RNA，其特征在于该基因为SEQ NO. 1所示的碱基序列。一种制备上述的用于抗胶质瘤增殖的干扰小分子RNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤为根据MAGic载体设计的具体要求，设计对应于LiM8基因388-406位，即 GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各为58bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列为SEQ NO. 1 Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATT TCA AGA GA ATG GAT TCC ATG TCT CAC CTT TTT TG-3'Anti-sense: 5，-MT TCA MA MG GTG AGA CAT GGA ATC CAT TCT CTT GAA ATG GAT TCC ATG TCT CAC C-3'；根据MAGic载体设计的具体要求，将设计的shRNA的寡核苷酸序列引物和MAGic质粒进行连接，得到用于抗胶质瘤增殖的干扰小分子RNA。一种上述的用于抗胶质瘤增殖的干扰小分子RNA在制备抗胶质瘤增殖的药物中的应用。本专利技术设计对抗胶质瘤增殖有关联的基因的RNAi，并应用胶质瘤细胞模型研究其对抗胶质瘤增殖的用，为RNAi在胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。附图说明图1为shRNA的寡核苷酸序列引物和Pmm^质粒的连接图。图2 Lin28下调抑制了胶质瘤细胞的增殖；感染LiM8干扰病毒3天为dayl，图中U251-pLVT148为LiM8干扰病毒。具体实施例方式一、胶质瘤细胞的培养胶质瘤细胞U251细胞系培养于37°C，5%C02恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，之后加入适量培养液并反复吹打以混勻细胞；将得到的细胞悬液移入15ml离心管中，1500rpm离心!Bmin ；去上清；用5ml无菌1 XPBS将细胞悬起，吹打混勻；加约Iml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37°C，5%0)2培养箱中培养，约2天左右传代1次(主要查看细胞有无铺满培养瓶)。二、人脑胶质瘤细胞的分离取人脑胶质瘤手术标本，浸入4°C的KRBB溶液 (Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液)中.清洗二次，然后将标本剪成小块，转移至盛有5mL 消化酶液的三角瓶中，于恒温摇床中37 °C保温，摇床转速lOOr/min，每IOmin玻璃管反复吹打一次，放置30min。将该悬液离心500-1000rpm，5min,最后剩下为胶质瘤细胞. 用细胞培养液悬起沉淀，在黑背景的显微镜下观察可发现到呈圆形的胶质瘤细胞。三、LIN28-RNAi质粒的设计和感染 1. LIN28-RNAi质粒的设计根据MAGic载体设计的具体要求，设计对应于LI拟8基因388-406位，即GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各为58bp，送华大基因研究中心进行合成； 所述的shRNA的寡核苷酸序列序列为 SEQ NO. 1Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATT TCA AGA GA ATG GAT TCC ATG TCT CAC CTT TTT TG-3'Anti-sense: 5，-MT TCA MA MG GTG AGA CAT GGA ATC CAT TCT CTT GM ATG GAT TCC ATG TCT CAC C-3'；根据MAGic中载体设计的具体要求，将设计的LIN28 -RNAi的干扰片段和MAGic质粒连接，参见图1，然后感染进胶质瘤细胞。图1为MAGic质粒原理的图解，使用基于RNA的CMV启动子和优化的终止子，从而在靶细胞内可以精确地形成小分子干扰RNA(shRNA)。shRNA 的表达质粒是一个预切好的备用载体。通过质粒上携带的筛选标记，进行哺乳动物细胞的共转染，可建立shRNA表达的稳定细胞系。通过两个MAGic的质粒各自与正义的DNA插入片段及反义的DNA插入片段相连接，便可介导shRNA的产生。或者单个质粒与一个具有发夹结构的DNA插入片段相连接，也可介导shRNA的产生。无论哪种方法，首先必须合成两段互补的DNA片段。而CMV启动子则控制着shRNA的生成(参附图1)。对于需要进行干扰的目的基因，选择一段靶序列为A2GN17C的DNA片段(靶序列的正义序列)，其GC含量接近 30-50% ο2. LI拟8-RNAi质粒的感染感染前一天，用0. 25%trpsin消化IOcm培养皿中汇合率达到85%左右的U373-MG细胞lmin，然后吹打制备单细胞悬液，使细胞悬液终密度达到3X IO5 cells/ml细胞。用该细胞悬液铺M孔板；每孔铺500ul，细胞贴壁24h后，用pLVT148病毒以M0I=20的浓度感染 U373-MG细胞。感染24h对U373-MG细胞进行换液操作，并以每孔hlO3 cells/well的密度将U373-MG细胞传代到5块96孔板中，从3rfd开始检测细胞增殖的变化，如图2。四、实验分组与检测指标正常对照组本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种靶向ＬＩＮ２８基因的干扰小分子ＲＮＡ及其抗胶质瘤增殖的用途，其特征在于该基因为ＳＥＱ　ＮＯ．１所示的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种靶向LIN^基因的干扰小分子RNA及其抗胶质瘤增殖的用途，其特征在于该基因为SEQ NO. 1所示的碱基序列。2.一种制备根据权利要求1所述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤为根据MAGic载体设计的具体要求，设计对应于LIN^基因 388-406位，即GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各为58bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列序列为SEQ NO. 1: Sense: 5'-CCG GGG TGA GAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏清梅，车丽花，殷珊，黄红军，陈国泽，潘讴东，
申请(专利权)人：上海生博生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31