本发明专利技术涉及一种用于抑制胶质瘤新生血管生成的小分子干扰RNA、其制备方法及其应用。该基因为SEQNO.1所示的碱基序列。本发明专利技术设计对与抑制胶质瘤新生血管生成有关联的基因的小分子干扰RNA，并应用胶质瘤细胞模型研究其对抑制胶质瘤新生血管生成的促进作用。为小分子干扰RNA在胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高效抗胶质瘤新生血管生成的小分子干扰RNA、其制备方法及其应用。
技术介绍
上世纪七十年代，Folkman在《新英格兰医学杂志》中首次提出了肿瘤生长依赖于新血管生成的理论假说，随着8年后毛细血管内皮细胞培养技术的建立，11年后第一个血管生成抑制剂的发现，13年后第一个血管生成活性蛋白的纯化等，这一观点为越来越多的证据所支持，并逐渐使这一领域成为肿瘤研究的热点。肿瘤血管生成在肿瘤的形成和转移过程中发挥了非常重要的作用，抑制肿瘤血管的生成是现代治疗肿瘤的一个重要策略。RNA干扰(RNA interference, RNAi),是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，生物体抑制特异的内源性mRNA表达的一种现象，而且mRNA发生降解，从而导致特定基因表达沉默。RNA干涉机制在细胞中以RNA分子双链形式出现，当双链RNA激活时，可以降低内源性mRNA分子水平的表达。当靶标mRNA分子消失时，相应的基因表达沉默。通过RNAi手段靶向下调胶质瘤新生血管生成关键关联基因STAT3的表达，为脑胶质瘤的治疗开辟一条新途径。在此处键入
描述段落。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种高效抗胶质瘤新生血管生成的小分子干扰RNA。本专利技术的目的之二在于提供该小分子干扰RNA的制备方法。本专利技术的目的之三在于提供小分子干扰RNA的应用。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种高效抗胶质瘤新生血管生成的小分子干扰RNA，其特征在于该基因为SEQ NO. 1所示的碱基序列。一种制备上述的高效抗胶质瘤新生血管生成的小分子干扰RNA，其特征在于该方法的具体步骤为根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求， 设计对应于 STAT3 基因 2214-2232 位，S卩GAT CAT GGA TGC TAC CAA T 的 shRNA 的寡核苷酸序列，各为53bp，送生工生物工程(上海)有限公司进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列为SEQ NO. 1 Sense 5'-aca ccG ATC ATG GAT GCT ACC AAT ttg ctt gaa ATT GGT AGC ATC CAT GAT Ct-3'Anti-sense: :5，_aaa aaG ATC ATG GAT GCT ACC AAT ttc aag caa ATT GGT AGC ATC CAT GAT Cg-3'；根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit基因质粒构建试剂盒中载体设计的具体要求，将设计的shRNA的寡核苷酸序列和PSil—质粒进行连接，得到高效抗胶质瘤新生血管生成的小分子干扰RNA。一种上述的高效抗胶质瘤新生血管生成的小分子干扰RNA在制备抗胶质瘤侵袭与抗新生血管生成药物中的应用。本专利技术设计对抑制胶质瘤新生血管生成有关联的基因的RNAi，并应用胶质瘤细胞模型研究其抗胶质瘤新生血管生成的促进作用。为RNAi在胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。具体实施例方式一、胶质瘤细胞的培养胶质瘤细胞U251细胞系培养于37°C，5%C02恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，再加入适量培养液以易于混勻细胞；用移液器将其移入 15ml离心管中，1500rpm离心!Bmin ；去上清；用5ml无菌IXPBS将细胞悬起，并吹打混勻； 加约Iml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37°C，5%0)2培养箱中培养， 约2天左右传代1次(主要查看细胞有无铺满培养瓶)。二、人脑胶质瘤细胞的分离取人脑胶质瘤手术标本，浸入4°C的KRBB溶液中. 清洗二次，然后将标本剪成小块，转移至盛有5mL消化酶液的三角瓶中，于恒温摇床中 37 °C保温，摇床转速100 r/min,每IOmin玻璃管反复吹打一次，放置30min，之后将该悬液离心IOOOrpm，离心5min，最后剩下的为胶质瘤细胞.在倒置显微镜下，胶质瘤细胞呈圆形.三、STAT3-RNAi 质粒的设计和转染根据 SilenCircle TM RNAi Transcription Kit 中载体设计的具体要求，设计对应于STAT3基因2214-2232位，S卩GAT CAT GGA TGC TAC CAA T的shRNA的寡核苷酸序列，各为5!3bp，并进行合成。STAT3-RNAi对应的序列为 SEQ NO. 1 Sense 5'-aca ccG ATC ATG GAT GCT ACC AAT ttg ctt gaa ATT GGT AGC ATC CAT GAT Ct-3'Anti-sense: :5，_aaa aaG ATC ATG GAT GCT ACC AAT ttc aag caa ATT GGT AGC ATC CAT GAT Cg-3'；根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求，将设计的 STAT3-RNAi的干扰片段和Psilma"^质粒连接，参见附图说明图1，然后转染进胶质瘤细胞。STAT3-RNAi质粒的转染转染前一天，在含有5ml无抗生素的DMEM培养基的60-mm培养皿里种上2 X IO6个胶质瘤细胞。然后用500 μ 1无血清的培养基(DMEM)溶解8. 0μ g的STAT3-RNAi表达载体，用500 μ 1培养基(DMEM)溶解Lipof ectamine^OOO (20 μ 1)，轻轻地混勻，再室温孵育5分钟。孵育5分钟后， 将shRNA表达载体与LipOfectamineTM2000充分混勻，室温孵育20分钟，以形成 DNA-Lipof ectamine 2000 的复合物。将 DNA-Lipof ectamine 2000 复合物加入到 60mm 培养皿里，之后细胞在37°C，5% CO2培养箱内培养6小时，换上正常细胞培养液。四、实验分组与检测指标正常对照组胶质瘤细胞，培养液为胶质瘤细胞培养液；RNAi组转染过RNAi的胶质瘤细胞，培养液为胶质瘤细胞培养液。胶质瘤细胞血管生成的检测将转染后的各组细胞悬液置于37 5% CO2的培养箱中培养Mh，取各组细胞培养上清液加入血管内皮细胞中，通过免疫细胞化学的方法和 HE染色，检测新生血管生成的情况，如图2。图1为ShRNA的寡核苷酸序列引物和Psilma"^质粒的连接图。图2 Mat3_RNAi对脑胶质瘤细胞增殖的影响，图为统计学分析图。由图可知，转染乂站3 RNA干扰质粒组的细胞新生血管数与血管分支数显著低于未转染组和转染空载体组的新生血管数与血管分支数。图中Mock-未转染质粒组；Empty vector-转染空载体组； Stat3 RNAi-转染Mat3 RNA干扰质粒组。五、结果说明转染Mat3 RNA干扰质粒组中的肿瘤新生血管生成受到抑制，新生血管数和分支数明显地减少。该实验结果表明，通过RNAi技术下调胶质瘤中的Mat3表达， 能有效地抑制肿瘤新生血管的生成。权利要求1.一种高效抗胶质瘤新生血管生成的小分子干扰RNA，其特征在于该RNA序列为SEQ NO. 1所示的碱基序列。2.一种制备根据权利要求1所述的抑制本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑大，武佳，叶思灵，车丽花，夏清梅，潘讴东，
申请(专利权)人：上海生博生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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