一种靶向外泌体进行基因载药的载体及其构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向外泌体进行基因载药的载体，包括CMV7启动子、选择性的标记Puromycin、抗性基因；在所述CMV7启动子和选择性的标记Puromycin之间的多克隆位点处加上如SEQ ID NO.1所示的EGFP‑F5/8 typeC序列。此外，本发明专利技术还公开了该载体的构建方法和应用。本发明专利技术载体使得外泌体能够最大限度携带外源基因，进行基因药物的递送。本发明专利技术载体的基因序列较小，能够增加携带基因的容量，拓宽了外源基因的选择余地。本发明专利技术载体的荧光效果更强，能够明显且直观的观察。

Carrier for gene delivery of target secretory body and its construction method and Application

The present invention discloses a vector targeting exosomes for gene drug delivery, including CMV7 promoter, selective marker Puromycin and resistance gene, and adds EGFP F5/8 type C sequence as shown in SEQ ID NO.1 to the polyclonal site between the CMV7 promoter and selective marker Puromycin. In addition, the invention also discloses the construction method and application of the carrier. The carrier of the invention enables the exocrine to carry the maximum foreign gene and deliver the gene drug. The gene sequence of the carrier of the invention is small, can increase the carrying capacity of the gene, and widens the selection space of the foreign gene. The carrier of the invention has stronger fluorescence effect and can be observed clearly and intuitively.

【技术实现步骤摘要】
一种靶向外泌体进行基因载药的载体及其构建方法及应用
本专利技术属于基因工程和生物
，尤其涉及一种载体，具体涉及一种靶向外泌体进行基因载药的载体；此外，本专利技术还涉及该载体的构建方法和应用。
技术介绍
外泌体是细胞分泌的细胞外囊泡，人体几乎所有细胞均可产生外泌体，如B细胞，T细胞，血细胞、肿瘤细胞等，且外泌体存在于所有的体液中，如尿液、血液、脑脊液等。外泌体直径大约在30nm到100nm之间。外泌体其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体包含的各种物质均来源于其细胞，如蛋白质，RNA，双链DNA，代谢分子。由于外泌体的体积非常小，这点优势使得他们可以逃避机体内的单核吞噬细胞系统的吞噬作用，并且可以穿过血管内皮细胞，到达下游的目的细胞。另外，还有研究发现外泌体甚至可以通过血脑屏障、胎盘屏障等。此外，外泌体具有生物来源的特点，使得其免疫原性比较低。外泌体可通过和其他细胞的细胞膜进行融合，发生内吞，从而将外泌体的内容物释放到下游细胞中来发挥作用，也可以通过细胞膜表面受体相互作用与靶细胞进行交流，将内含物释放至靶细胞中，运用此类方法，可以减少基因药物的降解，逃避溶酶体途径。传统的药物递送载体有病毒载体，纳米材料等。病毒载体虽然已有作为基因药物的运载工具，且有临床试验成功的先例，然而由于病毒载体会整合至整个基因组中以及突变回野生型病毒的风险存在，使得病毒载体在应用受到限制。纳米材料如脂质体，纳米颗粒等越来越多的应用于药物递送系统中，但是仍然存在生物相容性低，稳定性差等缺点，因此，外泌体作为一种细胞分泌的囊泡，是作为基因药物递送载体的最佳选择。存在的问题：目前，选用最多的是将外泌体的标志物即四跨膜蛋白CD63，CD81，CD9作为引导，将其他目的基因或者荧光蛋白，与标志物蛋白进行融合表达，从而将表达的外源基因引导带至外泌体中。然而，运用类似此类标志物有以下几个弊端：第一就是自身基因较大，受载体限制，使得外源基因的选择余地比较小；其次，此类标志物蛋白靶向性比较差，在细胞器膜上，同样也富含此类蛋白，所以导致转化率比较小，效率较低。另外，CD63，CD9，CD81被视为细胞功能的重要蛋白，利用此类蛋白做引导，势必会影响细胞或者是外泌体的功能。因此，开发能够有效且有特异性，且不影响细胞、外泌体功能的具有靶向外泌体的载体就成为需要迫切解决的一个技术问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种可以靶向外泌体进行基因载药的载体，通过使用分泌蛋白Retinoschisin的F5/8typeC的区域，即Retinoschisin基因的第59-244氨基酸，能够使得连接的蛋白质能够特异引导到细胞外囊泡的膜上，从而使外源的基因物能够包裹进外泌体中，由于使用的是肽段，使得外泌体能够最大限度携带外源基因，进行基因药物的递送。本专利技术要解决的技术问题之二是提供该载体的构建方法。本专利技术要解决的技术问题之三是提供该载体的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：在本专利技术的第一方面，提供一种靶向外泌体进行基因载药的载体，包括CMV7启动子、选择性的标记Puromycin、抗性基因；在所述CMV7启动子和选择性的标记Puromycin之间的多克隆位点处加上如SEQIDNO.1所示的EGFP-F5/8typeC序列。其中，抗性基因即抗生素抗性基因，在一个细菌群体中，不是所有的个体都有该基因，其目的是使成功导入载体的细菌对抗生素产生抗性，从而能够筛选并扩增载体，常见的抗性基因有Ampicillin氨苄青霉素，Kanamycin卡那霉素等。所述CMV7启动子是指属疱疹病毒亚β科的CMV基因，该基因可指导多个基因的表达，是大家公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子。所述选择性的标记Puromycin指嘌呤霉素，该基因属于抗性的遗传基因，属于选择基因的一种，大多用于真核细胞的筛选。常见的真核筛选基因有Neomycin新霉素、Hygromycin潮霉素等。作为本专利技术优选的技术方案，所述抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。作为本专利技术优选的技术方案，所述载体还包括多克隆位点（MultipleCloningSite，简称MCS），MCS是包含多个（最多20个）限制性酶切位点（restrictionsite）的一段很短的DNA序列，是外源基因插入的位置。该多克隆位点MCS用于插入荧光或其他蛋白质、基因、靶向小分子。所述载体可以为慢病毒载体，后续可以通过进行病毒包装、纯化得到，慢病毒颗粒。所述载体也可以为腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等其他病毒载体。在本专利技术的第二方面，还提供上述载体的构建方法，该方法包括如下步骤：第一步，合成目的基因Retinoschisin的F5/8typeC的区域，即Retinoschisin基因的第59-244氨基酸；第二步，将该基因构建至病毒载体PLVX-CMV7-MCS-EF1-Puro中。作为本专利技术优选的技术方案，第一步具体为：（1）根据GeneBank中人MFGE8的mRNA上CDS序列、人RS1的mRNA上CDS序列、EGFP标签蛋白序列、linker标签序列的基因信息，设计EcoRI-MFGE8(1-23aa)-EGFP-linker-RS1（59-224aa）-XhoI基因DNA片段，合成双链DNA分子；（2）分别用合成的引物，如SEQIDNO.2所示的PSE2705-F和如SEQIDNO.3所示的PSE2705-R来PCR步骤（1）合成的双链DNA分子，得到PCR产物。作为本专利技术优选的技术方案，第二步具体为：1）用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切病毒载体PLVX-CMV7-MCS-EF1-Puro，回收载体骨架；2）将步骤(2)的PCR产物和步骤1)的载体骨架重组，转化进大肠杆菌，筛选阳性菌并提取其质粒，得到重组载体。作为本专利技术优选的技术方案，步骤（2）中，所述PCR的体系如下：32.5ulH2O，10ul5×Buffer缓冲液（含有Mg2+），4uldNTP（各2.5mM），1ul正向引物Primer1（＋），1ul反向引物Primer2（－）（10uM），1ul目的基因模板DNA，以及0.5ul的PrimeSTAR酶，组成反应体系；所述PCR程序如下：98℃，变性3分钟；退火98℃10秒，55℃15秒，72℃1分钟，重复30个循环；延伸72℃10分钟。作为本专利技术优选的技术方案，步骤1）中，所述酶切体系为：EcoRI:1μL，XhoI:1μL，缓冲液:3μL，PLVX-CMV7-MCS-EF1-Puro质粒:1μg，补充水至30μL；37℃酶切4小时。作为本专利技术优选的技术方案，步骤2）中，所述重组体系为：重组酶:15μL，回收的PCR产物DNA:40ng，回收的质粒:20ng；42℃水浴30min后，转化进大肠杆菌。在本专利技术的第三方面，还提供该载体在制备靶向外泌体进行基因药物递送的产品中的的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术构建的序列片段，可以特异性靶向引导至外泌体。本专利技术的基因序列为558bp，能够增加携带基因的容量，以往CD9为717bp，CD63为687bp，CD81为711bp。本专利技术载体的基因序列较小，能够增加携本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向外泌体进行基因载药的载体，其特征在于，包括CMV7启动子、选择性的标记Puromycin、抗性基因；在所述CMV7启动子和选择性的标记Puromycin 之间的多克隆位点处加上如SEQ ID NO.1所示的EGFP‑F5/8 typeC序列。

【技术特征摘要】
1.一种靶向外泌体进行基因载药的载体，其特征在于，包括CMV7启动子、选择性的标记Puromycin、抗性基因；在所述CMV7启动子和选择性的标记Puromycin之间的多克隆位点处加上如SEQIDNO.1所示的EGFP-F5/8typeC序列。2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体还包括多克隆位点MCS，该多克隆位点MCS用于插入荧光或其他蛋白质、基因、靶向小分子。4.如权利要求1-3任一项所述的载体的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：第一步，合成目的基因Retinoschisin的F5/8typeC的区域，即Retinoschisin基因的第59-244氨基酸；第二步，将该基因构建至病毒载体PLVX-CMV7-MCS-EF1-Puro中。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，第一步具体为：（1）根据GeneBank中人MFGE8的mRNA上CDS序列、人RS1的mRNA上CDS序列、EGFP标签蛋白序列、linker标签序列的基因信息，设计EcoRI-MFGE8(1-23aa)-EGFP-linker-RS1（59-224aa）-XhoI基因DNA片段，合成双链DNA分子；（2）分别用合成的引物，如SEQIDNO.2所示的PSE2705-F和如SEQIDNO.3所示的PSE2705-R来PCR步骤（1...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐凡，吴小江，顾莉萍，余虹，
申请(专利权)人：上海生博生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31