本发明专利技术提供用于检测循环血样本和骨髓样本中肿瘤细胞的方法与试剂，即应用肿瘤特异性启动子驱使报告基因表达，来检测血样本和骨髓样本中的肿瘤细胞。肿瘤特异性启动子，如人端粒酶逆转录酶启动子(TERT)，在大多数肿瘤细胞中有很高的活性，但是在正常细胞中没有活性。用含有肿瘤特异性启动子驱使的报告基因表达盒的基因载体，例如腺病毒载体，转染血样本或骨髓样本中的有核细胞，然后检测样本中是否存在报告基因高表达的细胞，从而确认样本中是否存在肿瘤细胞。本发明专利技术提供包含所述启动子，报告基因和载体的诊断试剂盒，可用于癌症患者的早期诊断及治疗反应的预测。
【技术实现步骤摘要】
应用肿瘤特异性启动子表达报告基因来检测循环血中肿瘤细胞的方法和试剂大多数癌症患者死于肿瘤转移，转移是指肿瘤细胞通过循环系统从原发部位扩散到远离部位，并在新的器官中繁殖生长成新的转移瘤(Ecclesand Welch，2007)。据估计，每克肿瘤组织每天约有106细胞进入血液(Chang et al. ,2000 ；Butler and Gullino，1975)， 不过这其中的大部分很快会清除(Butler and Gullino, 1975 ；Luzzi et al.，1998)。但是，众所周知，肿瘤细胞的侵入和转移在早期就会发生，甚至在癌症确诊前的很多年就会发生。因此，检测血液中的循环肿瘤细胞是癌症早期诊断的有效方法(Husemarmet al.,2008；Gray, 2003 ；Kohn and Liotta，1995)。另外，最近一项研究表明手术前的循环肿瘤细胞(CTC)水平与癌症患者的总存活期存在相关性，而且术前术后循环肿瘤细胞数量的比较可能是治疗反应的指示剂(Scher et al. ,2009 ；de Bono et al.，2008)。因此，有效的检测循环血中肿瘤细胞不仅有益于癌症的早期诊断，而且对预后和治疗反应很有帮助。目前检测循环血中肿瘤细胞的方法有三种1)检测上皮细胞特异性蛋白的免疫测定；幻基于分子测定的检测肿瘤或上皮细胞特异性mRNA的PCR方法；幻检测与癌症有关的染色体畸变或基因扩增的荧光原位杂交。免疫测定是通过使用固定在磁性颗粒上的抗体来捕获表达某些组织、器官或肿瘤特异性抗原的细胞。由于大多数实体瘤来自上皮细胞源的细胞，因此在上皮细胞中特异性表达的蛋白(如角蛋白 cytokeratins(19，8，18and 20)和 EpCam(Litvinov et al.， 1994))已经被用作区分上皮细胞病和有核血细胞的生物标志物。但是，这个方法可能会导致一些假阳性或假阴性结果。第一，因为入侵的肿瘤细胞因上皮细胞向间质细胞转变， 而丢失原有的上皮抗原，这将导致假阴性结果(ffillipinski-Stapelfeldt et al. ,2005 ； Went et al.，2004)。第二，非肿瘤上皮细胞可能会存在于血液中，或者抗体可能会非特异性地与血细胞结合，这将导致假阳性结果。据估计，在正常对照中，约0% -20%的角蛋白 cytokeratin阳性细胞是白细胞(Goeminne etal. ,2000)。同时用血细胞特异性的抗体(如 CD45)对染可能会减少假阳性。抗器官特异性标志物的抗体，如前列腺特异抗原(PSA)，癌胚抗原(CEA)，mucin-l (MUC-I)，表皮生长因子受体(EGFR)，癌胚蛋白(AFP)，HER-2，也被用来检测循环肿瘤细胞，不过由于不是所有的肿瘤细胞都表达那些生物标志物，所以经常会产生假阴性结果。但是此方法的优点是可以用别的方法，如形态学、mRNA或基因扩增测定， 来富集和分析磁性颗粒捕获的循环血肿瘤细胞。循环血肿瘤细胞也可以通过其物理特性 (如大小和密度)富集。大部分血白细胞(淋巴细胞和中性粒细胞)的大小是8 llum， 而乳腺癌患者血液中肿瘤细胞的平均直径是四 35um(Meng et al.，2004)。使用荧光原位杂交(FISH)，比较基因组杂交(CGH)和突变分析等染色体组学分析可以进一步证明癌症是相关的染色体畸变、基因扩增、突变的存在(Swermenhuis et al. ,2009 ；Leversha et al. ,2009) 但是这些方法通常费用昂贵，而且耗时。反转录 PCR(RT-PCR)，尤其是实时定量反转录PCR，是一种敏感的、实际的，用来检测某些组织或器官(如上面提及的上皮细胞和器官特异性蛋白)的mRNAs特异性的方法(Kitago et al.，2009； Iakovlevet al.，2008)。此方法可以与免疫测定法结合使用。例如，与免疫磁珠富集的循环血肿瘤细胞可以被进一步分析它们的组织或肿瘤特异性mRNAs的含量。虽然PCR方法在检测信号方面灵敏度高，但是需要采取严格的控制，避免过程中可能会产生的污染。由于缺乏高肿瘤特异性分子，免疫测定法和定量反转录PCR法的应用受到限制， 因此测定循环血肿瘤细胞的存在需要分析多种分子标志物。我们研发出一种新的检测血标本和骨髓标本中肿瘤细胞的方法。此方法使用由组织或肿瘤特异性启动子驱使报告基因表达，达到肿瘤细胞的检测目的。由报告基因驱使的肿瘤特异性启动子的表达盒被转染到血标本和骨髓标本中有核细胞中。然后培养细胞 12-48小时。随后用不同的方法和试剂检测报告基因的表达。表达盒运载所用的载体会在肿瘤细胞中，而不是在有核血细胞中有选择性地扩增或表达，所以检测出的信号对肿瘤细胞的特异性更高。基于所用的方法和用来检测报告基因的信号强度可以测定血标本和骨髓标本中的循环肿瘤细胞。此方法可靠，简单，在检测血标本和骨髓标本中的循环肿瘤细胞方面特异性高，并且对癌症患者的早期诊断，治疗反应的预测及其预后非常有益。可用于此目的的报告基因包括编码各种荧光蛋白(如绿色、红色、蓝色、黄色、 紫色荧光蛋白)的基因，萤火虫荧光素酶基因，海肾荧光素酶基因，细菌半乳糖苷酶 (LacZ)基因等。上述报告基因的表达可以由不同的方法检测。荧光蛋白的表达可以由荧光显微镜和荧光激活流式细胞分析法(FACQ检测。观察荧光显微镜下的细胞可以对细胞的大小和形状进行分析，这可能有益于进一步区分正常细胞和肿瘤细胞。荧光激活流式细胞分析法可以富集荧光阳性细胞，并进一步采用传统方法验证，如用免疫测定法和PCR测定法，进一步确认细胞。生物发光测定法可以检测萤火虫荧光素酶基因，海肾荧光素酶基因，细菌半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达。启动子是调控细胞表达的顺式序列。有些启动子不论其组织类型，生物种类，发育阶段，在大多数细胞中有活性。这种启动子叫做泛在启动子 (ubiquitous promoter)，如巨细胞病毒早期启动子(CMV)，劳斯肉瘤病毒长末端重复序列 (RSV)，SV40病毒启动子，PGK和EFl α启动子。有些启动子仅在某些类型的细胞中有活性。 例如，白蛋白启动子主要在肝细胞中有活性，probasin和前列腺特异性抗原启动子在前列腺组织中有活性。有些基因只在肿瘤细胞中表达，其转录调控序列是肿瘤特异性的。但是， 尽管可能这些启动子在肿瘤细胞中的活性比在正常细胞中的活性高一些，大多数启动子是组织或细胞型特异性的，而不是肿瘤特异性的。它们仅在一些肿瘤细胞中有活性。如肝癌的甲胎蛋白α，前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)，胃癌的癌胚抗原(CEA)就是这样的例子。酪氨酸酶启动子在黑色素瘤中有活性，mucin-1启动子在粘膜细胞中有活性。相反，人 survivin基因，端粒体反转录酶基因(TERT)，midkine基因在很多种癌症中有活性。组织或肿瘤特异性启动子已经被用来在一些细胞或肿瘤细胞中的基因特异性表达。例如，这些启动子已经被用于癌症基因疗法中治疗基因的肿瘤特异性表达。有时这些启动子也用于转基因动物，控制某些特定组织中转基因的表达。端粒酶是一种特别的反转录酶，它负责染色体末端或端粒的复制(Morin，1989 ； B本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种肿瘤特异性启动子，其在肿瘤细胞中的活性比其在正常细胞中的活性要高。
【技术特征摘要】
1.一种肿瘤特异性启动子，其在肿瘤细胞中的活性比其在正常细胞中的活性要高。2.权利要求1的肿瘤特异性启动子，其包括人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，MUC-I启动子和probasin基因启动子。3.权利要求1的肿瘤特异性启动子，其可以是组织或者细胞型特异性基因的原启动子，也可以是经改造的组合启动子，例如含有源自组织或细胞型特异性启动子的序列和源自其他启动子的增强子的嵌合型启动子。4.权利要求3的肿瘤特异性启动子，其中所述肿瘤特异性启动子是改造的人端粒酶逆转录酶启动子，其含有人端粒酶逆转录酶启动子序列以及源自CMV启动子的增强子序列。5.权利要求4的肿瘤特异性启动子，所述启动子序列如SEQID N0:8所示。6.一种载体，其是包括由权利要求1-5任一项的肿瘤特异性启动子驱使表达的报告基因的基因表达载体。7.权利要求6的载体，其中提及的报告基因是一种通常作为启动子活性指示剂的基因。8.权利要求7的载体，其中所述报告基因包括荧光蛋白(绿色，红色，黄色和蓝色荧光蛋白)的基因，萤火虫荧光素酶基因，海肾荧光素酶基因，细菌半乳糖苷酶(LacZ)基因。9.权利要求7的载体，其中所述基因表达载体指任何一种用于基因转染的载体。10.权利要求7的载体，其中所述基因表达载体包括质粒，质粒/脂质复合物以及病毒载体。11.权利要求10的载体，其中提及的病毒载体是指复制缺陷型病毒载体和可复制型病毒载体，例如腺病毒载体，可复制型腺病毒载体，疱...
【专利技术属性】
技术研发人员：方效良，
申请(专利权)人：浙江东方基因生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：33
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