一种基于人工神经网络的重组毕赤酵母表达期两阶段在线故障诊断方法技术

一种基于人工神经网络的重组毕赤酵母表达期两阶段在线故障诊断方法，属于生物技术领域。本发明专利技术方法步骤为：（１）确定发酵诱导期最优化的ｐＨ值以及甲醇浓度变化曲线；（２）分析表达期的代谢特征和过程参数，依据乙醇氧化酶活性变化趋势，把表达期分成两个阶段；（３）获取表达期的过程参数；（４）建立两个自联想人工神经网络；（５）对人工神经网络进行训练和测试；（６）利用通过测试的人工神经网络进行在线故障诊断；（７）当系统提示出现故障时，离线分析，对比最优化的ｐＨ和甲醇浓度变化曲线，确定故障类型，采取相应措施。毕赤酵母表达外源蛋白的过程中，表达期甲醇浓度和ｐＨ是重要的控制参数，该故障诊断方法能够在线快速准确地诊断出甲醇电极和ｐＨ电极的各种故障。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于人工神经网络的重组毕赤酵母发酵表达人血清白蛋白-人白介素2融合蛋白表达期两阶段在线故障诊断方法，属于生物

技术介绍
白介素(interleukin)是由人体白细胞分泌的一类调节细胞生长和分化的细 胞因子。许多白介素正在用于临床治疗癌症、感染性疾病和艾滋病的研究中。 目前白介素2 (IL-2)是医药界公认的基因工程药物中最具有使用价值的药品之 一。本专利技术涉及的产品是将白介素2 (IL-2)和人白蛋白(HSA)进行基因融合、 构建并得到的可在毕赤酵母中实现高效表达人白蛋白融合共表达药物 (IL-2-HAS融合蛋白)基因的重组毕赤酵母，并利用该菌生产长效化IL-2。 IL-2 长效制剂可显著提高药物的生物利用度，有望大幅度降低给药剂量，减少每个 临床治疗疗程的给药次数，预计可降低多次密集和大剂量给药所带来的副作用， 并减轻频繁给药对患者所造成的痛苦。在毕赤酵母表达重组融合蛋白(白介素_2_人白蛋白，以下简称IL-2-HAS)过程中，在诱导期如何准确有效的控制甲醇的浓度和pH值的稳定性直接决定了 IL-2-HAS表达量的高低。甲醇电极的原理是基于甲醇的挥发检测，容易受环境 条件和其他挥发性物质的影响，出现以下一些问题测量值不稳定、线性范围 比较小；当实际浓度不在标定的范围内时，测量值在极值附近波动；显示值和 实际值之间存在偏移等。同时，在发酵后期，菌体浓度较高，菌体大量死亡， 发酵液粘度相对较高，电极膜的通透性下降，也会造成测量值偏低。因此完全 依赖甲醇电极的反馈控制系统存在很大的风险， 一旦出现故障可能直接导致发 酵失败。由于pH值在菌体生长期和诱导期一般都不一致，在发酵过程中要进行 pH值的调整，同时发酵周期相对较长，pH值也容易出现漂移。综上所述，在 没有有效改进甲醇电极和pH电极稳定性之前，发酵过程中能够及时发现并排除 电极故障对于保障发酵生产的顺利进行有重要意义。以前提出了各种基于神经网络的故障诊断方法，但大都基于复杂的数据分 析和各种网络的构建，没有具体结合发酵过程的特性，菌体的代谢以及生理状 态分析，参数的选择也没有针对不同的阶段，识别的效果相对较差。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于人工神经网络的重组毕赤酵母表达期两阶段在线故障 诊断方法，该方法能够准确快速的诊断出各种故障，提高了发酵生产的稳定性。本专利技术的技术方案 一种基于人工神经网络的重组毕赤酵母表达期两阶段 在线故障诊断方法，步骤如下(1) 确定发酵诱导期最优化的pH值以及甲醇浓度变化曲线；(2) 分析表达期的代谢特征和过程参数，依据乙醇氧化酶活性变化趋势， 把表达期分成两个阶段；(3) 获取表达期的过程参数；(4) 建立两个自联想人工神经网络；(5) 对人工神经网络进行训练和测试；(6) 利用通过测试的人工神经网络进行在线故障诊断；(7) 当系统提示出现故障时，对比最优化的pH和甲醇浓度变化曲线，确 定故障类型，采取相应措施。所述最优化的pH值以及甲醇浓度变化曲线必须通过至少5批正常发酵批次 才能实现。最适合白介素-2-人白蛋白重组融合蛋白表达的pH值是6.0。所述表达期代谢特征和过程参数分析是分析乙醇氧化酶AOX酶活变化趋 势，从诱导开始到酶活最大时为第一阶段，从酶活最大到发酵结束为第二阶段。所述获取表达期的过程参数为根据阶段特性的参数选择，第一阶段特性的 参数是甲醇的添加量、氨水添加量、溶解氧浓度、二氧化碳的生成速率CER; 第二阶段特性的参数是甲醇的添加量、氨水添加量、搅拌转速、氧气的消耗速 率OUR;同时还必须把所有数据归一化到0 1之间。所述的两个人工神经网络都是自联想神经网络，各个神经网络训练时网络 采用相同的输入层和输出层，从输入层、映射层、瓶颈层、映射层至输出层各 层的节点数分别为4， 7， 2， 7， 4;映射层和瓶颈层神经元的传递函数采用S型 (sigmoid)传递函数。所述神经网络训练和测试是把历史数据分成两个部分，5批正常的数据作为 训练样本，3批不同故障的数据和其他2批正常发酵的数据用来作为故障检验。所述的神经网络的训练是采用误差反向传播算法进行训练。所述神经网络进行测试，当步骤(5)的对于未参加训练的2批正常发酵数 据和3批非正常发酵的数据，能做出正确的诊断，对故障作出响应的时间在3 小时之内，然后才能进行步骤(6)的在线故障诊断工作。用正常发酵数据作为神经网络的输入数据时，评价因子J值接近于零；在采 用非正常发酵数据作为神经网络的输入数据时，J值大于零；故障判定阈值f设 定为0.12，当计算的误差/值小于或等于f ，发酵的状态被认为是正常的；当J 值高于f，发酵的状态被认为是异常的。所述利用神经网络进行在线故障诊断时，先将在线参数归一化到0 1之间， 再进行输入，根据输出再计算后判断故障。利用神经网络进行故障诊断时，确定故障类型需离线检测pH值和甲醇浓度。 本专利技术的有益效果本专利技术诊断方法能够在线快速准确地诊断出甲醇电极 和pH电极的各种故障。同样的故障，当采用单一的自适应人工神经网络时，有 的不能诊断，有的滞后明显。在发现故障后，通过釆用相应的故障恢复措施，最后的IL-2-HAS表达量比不采取措施前能提高两倍。通过建立在线故障诊断方 法，进一步提高了发酵的稳定性，该方法能够推广到重组毕赤酵母表达其他外 源蛋白的发酵生产中。 附图说明图l基于人工神经网络的在线故障诊断方法系统示意图。 图2自联想人工神经网络结构示意图。 图3最优化发酵条件下的甲醇浓度随时间的变化曲线。 图4甲醇诱导期乙醇氧化酶(AOX)活性变化趋势。图5正常发酵、甲醇电极故障及pH电极故障情况下的诊断结果。(a)正常 发酵时的评价因子/值图，(b)甲醇浓度过高时的评价因子J值图，(c)pH值过低 时的评价因子J值图。图6甲醇浓度过高时的故障以及处理方法(添加甘油调节活性)。(a)当发酵 在60小时左右出现甲醇浓度过高故障时的评价因子J值图，(b)当限制性添加甘油时的尾气中C02分压变化图。具体实施例方式下面结合实例对本专利技术的基于人工神经网络的重组毕赤酵母表达期两阶段 在线故障诊断方法做出详细说明。(1) 最优化pH值和甲醇浓度变化曲线。诱导期pH值和甲醇浓度直接影响了细胞的生理状态和目的蛋白的表达量。 经过多次重复实验确定了最优化的pH值和甲醇浓度变化曲线。在整个表达期控 制pH值在6.0最有利于蛋白的表达。从培养28小时开始混加甲醇，4个小时后 甲醇浓度大约为0.2g/L,从32小时到42小时控制甲醇的流加速度使得甲醇浓度 缓慢上升到5g/L，从42小时到56小时适当提高甲醇的流加速度使甲醇浓度逐渐 上升到20g/L。从56小时开始保持20g/L的甲醇浓度不变直至发酵结束(如图3 )， 这个流加过程对应于酵母对甲醇的逐渐适应的过程。(2) 表达阶段代谢特性和过程参数分析，把表达期分成两个阶段。 AOX是甲醇代谢的第一个酶，将甲醇氧化为甲醛，同时释放l单位的过氧化氢。甲醛再被甲醛脱氢酶(FAD)氧化，形成l单位的s-甲醛谷胱甘肽，然后在 甲酸脱氢酶的作用下形成C02，并重新释放谷胱甘肽。由于AOX的诱导效果将 直接影响发酵过程中毕赤酵母对甲醇的利用情况以及目的蛋白的表达，因此， 研究AOX在诱导初期本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于人工神经网络的重组毕赤酵母表达期两阶段在线故障诊断方法，步骤如下：　（１）确定发酵诱导期最优化的ｐＨ值以及甲醇浓度变化曲线；　（２）分析表达期的代谢特征和过程参数，依据乙醇氧化酶活性变化趋势，把表达期分成两个阶段；　 　（３）获取表达期的过程参数；　（４）建立两个自联想人工神经网络；　（５）对人工神经网络进行训练和测试；　（６）利用通过测试的人工神经网络进行在线故障诊断；　（７）当系统提示出现故障时，对比最优化的ｐＨ和甲醇浓度变化 曲线，确定故障类型，采取相应措施。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高敏杰，史仲平，郑志永，金虎，詹晓北，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]