用于检测丁酰胆碱酯酶的近红外半菁类荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及丁酰胆碱酯酶的检测领域，公开了一种用于检测丁酰胆碱酯酶的近红外半菁类荧光探针及其制备方法和应用，具体的，所述近红外半菁类荧光探针具有式(1)所示的结构。所述方法包括在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式(2)所示的化合物与环丙基甲酰氯接触。应用包括：在检测丁酰胆碱酯酶的活性中的应用，一种丁酰胆碱酯酶的活性的检测方法和检测试剂盒。本发明专利技术的近红外半菁类探针化合物用于与羧肽酶Y活性检测有关的应用时，灵敏度高、选择性好、荧光强度的变化大易于检测，稳定性更高、使用更方便、价格更低廉。

Near infrared half cyanine fluorescent probe for detecting butynyl cholinesterase and its preparation method and Application

The present invention relates to the detection field of butylyl cholinesterase, and discloses a near infrared semi cyanine fluorescent probe for the detection of butylyl cholinesterase and its preparation method and application, in particular, the near infrared semi cyanine fluorescent probe has the structure shown by (1). The method includes contacting the compound shown in formula 2 with cyclopropyl formyl chloride in the presence of an acid binding agent in the presence of nucleophilic reaction conditions and in the presence of an acid binding agent. Applications include: application in the detection of butylcholinesterase activity, detection of butyrate cholinesterase activity and detection kit. The near infrared semi cyanine probe compound is used in the application of the detection of carboxypeptidase Y activity, with high sensitivity, good selectivity, high fluorescence intensity change and easy detection, higher stability, more convenient use and cheaper price.

【技术实现步骤摘要】
用于检测丁酰胆碱酯酶的近红外半菁类荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及丁酰胆碱酯酶的检测领域，具体地，涉及一种近红外半菁类荧光探针，该近红外半菁类荧光探针的制备方法和在检测丁酰胆碱酯酶的活性中的应用，以及一种丁酰胆碱酯酶的活性的检测方法和丁酰胆碱酯酶活性的检测试剂盒。
技术介绍
丁酰胆碱酯酶(BChE)主要以乙酰胆碱酯酶的一种同工酶存在于生物体内，它是由肝脏合成的一种非特异性酯酶，由于该酶在肝脏中合成后立即释放到血浆中，因此血清中BChE活性是测定肝细胞蛋白质合成功能的灵敏指标。随着检测技术和临床诊疗水平的不断提高，丁酰胆碱酯酶除了用于评估肝脏储备功能，还扩展到恶性肿瘤、神经系统性疾病、心血管疾病、代谢综合症等众多疾病的检测和诊断领域当中。此外，在临床中，测定血清胆碱酯酶活性也是协助诊断有机磷化合物(如有机磷毒气、有机磷农药)和可卡因等中毒的重要途径。现有测定丁酰胆碱酯酶活性的方法主要有三种。第一种是用紫外吸收光谱法(即Ellman方法)来测试待测样品中的胆碱酯酶活性，主要是通过以硫代乙酰胆碱或硫代丁酰胆碱作为底物，所生成的硫代胆碱与Ellman试剂(5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸)生成黄色物质。第二种是用荧光光谱法来测试待测样品中的胆碱酯酶活性，主要是通过以硫代乙酰胆碱或硫代丁酰胆碱作为底物，利用识别硫代胆碱的荧光探针进行间接监测酶的活性。第三种直接用同位素标记的天然底物乙酰胆碱或丁酰胆碱，直接测定待测样品中的胆碱酯酶活性。以上方法中，前面两种属于间接方法，容易造成误差；第三种方法虽然是直接方法，但是操作过程较为复杂，且均需要昂贵的大型仪器与检测费用才能实现，也对安全造成很大的压力。不仅如此，上述三种方法均不能区分丁酰胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶，因为所测得的活性是所有胆碱酯酶的总活性。因此，设计开发基于有机小分子作为直接的底物型荧光探针，进而建立灵敏、简单、经济的特异性丁酰胆碱酯酶活性检测方法是非常迫切和必要的。然而目前为止，国内外较少关于特异性底物型荧光探针用于检测丁酰胆碱酯酶(EC号:3.1.1.8)活性的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提供了一种高选择性、高灵敏度、性质稳定、操作简便、易于储运且成本低廉的非肽底物型丁酰胆碱酯酶检测荧光探针及其制备方法和应用。为达到上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种近红外半菁类荧光探针，其特征在于，所述近红外半菁类荧光探针具有式(1)所示的结构：第二方面，本专利技术提供了上述近红外半菁类荧光探针的制备方法，该方法包括在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式(2)所示结构化合物与环丙基甲酰氯接触；第三方面，本专利技术提供上述近红外半菁类荧光探针在检测丁酰胆碱酯酶的活性中的应用。第四方面，本专利技术提供了一种丁酰胆碱酯酶的活性的检测方法，其中，该方法包括：将待测样品与如上所述的近红外半菁类荧光探针接触，使得待测样品中的丁酰胆碱酯酶被所述红外半菁类荧光探针中的环丙甲酰基所识别，得到接触后的物料HCY；检测接触后的物料HCY在激发光下发出的荧光强度随时间的增加值，所述荧光强度随时间的增加值指示了待测样品中丁酰胆碱酯酶的活性；所述激发光的波长为450-750nm，所述荧光的发射波长为680-800nm。第五方面，本专利技术提供一种丁酰胆碱酯酶活性的检测试剂盒，该检测试剂盒包括：如上所述的近红外半菁类荧光探针、丁酰胆碱酯酶标准品以及反应缓冲液。本专利技术的近红外半菁类荧光探针在用于检测丁酰胆碱酯酶活性时，与丁酰胆碱酯酶具有更高的亲和力，检测的有效性更高。在用于检测丁酰胆碱酯酶的活性时，与采用多肽类荧光探针相比，具有更高的灵敏度和选择性；且合成的方法简单快速，荧光背景值低。因此，本专利技术提供的近红外半菁类探针化合物荧光探针用于与丁酰胆碱酯酶活性检测有关的应用时，灵敏度高、选择性好、荧光强度的变化大，易于检测，并且本专利技术的近红外半菁类探针化合物为非肽类的底物型荧光探针，非肽类荧光探针相比于肽类荧光探针稳定性更高、使用更方便、价格更低廉。底物型荧光探针相比于抑制型荧光探针本底值更低、对细胞毒性更低。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1反映了式(1)所示结构的近红外荧光探针与丁酰胆碱酯酶作用前后在有效波段下的荧光强度变化。图2是式(1)所示结构的近红外半菁类荧光探针对丁酰胆碱酯酶的专一性示意图。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。一方面，本专利技术提供了一种近红外半菁类荧光探针，该近红外半菁类荧光探针具有式(1)所示的结构；其中，在式(1)所示的近红外半菁类荧光探针中，以环丙甲酰基作为丁酰胆碱酯酶的识别基团。第二方面，本专利技术还提供了如上所述的近红外半菁类荧光探针的制备方法包括：其中，在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式(2)所示结构化合物与环丙基甲酰氯接触；在本专利技术所述的近红外半菁类荧光探针的制备方法中，所述亲核反应为式(2)中的羟基与环丙基甲酰氯发生的反应，所述亲核反应的条件包括温度为零下5℃至30℃，时间为10-200min，优选情况下，所述亲核反应的条件为温度为0-25℃，时间为80-160min。本专利技术所述的近红外半菁类荧光探针的制备方法中，所述接触需要在缚酸剂存在的条件下进行，所述缚酸剂可以为本领域常用的任何能够吸收反应中产生的酸，避免接触反应中生成的酸影响反应或反应平衡的物质，优选地，所述缚酸剂选自三乙胺、二乙胺、二异丙基胺、吡啶、N,N-二甲氨基吡啶、2,6-二甲基吡啶、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种，最为优选地，所述缚酸剂为三乙胺。为了提高接触反应传质和传热的效果，本专利技术所述接触反应在有机溶剂环境中进行，所述有机溶剂可以为任何能够在本专利技术所述接触条件下不与本专利技术的反应物发生反应并能为反应提供适宜的溶液环境的有机溶剂，所述有机溶剂的沸点优选为30-150℃，更为优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、四氯化碳、乙腈、丙酮、乙二醇二甲醚、N,N-二甲基甲酰胺和1,2-二氯乙烷中的至少一种，最为优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷。在本专利技术的近红外半菁类荧光探针的制备方法中，相对于1毫摩尔的式(2)所示结构化合物，所环丙基甲酰氯的用量为1-2毫摩尔；所述缚酸剂的用量没有特别的限制，为了达到好的对反应生成的酸的吸收效果，所述缚酸剂的用量可以为1-3毫摩尔，优选情况下，所述缚酸剂的用量为2-3毫摩尔；用于本专利技术的有机溶剂的用量也没有特别的限制，优选情况下，所述有机溶剂的用量为20-30毫升。在本专利技术所述的近红外半菁类荧光探针的制备方法中，可以用薄层色谱(TLC)对反应的进行情况进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种近红外半菁类荧光探针，其特征在于，所述近红外半菁类荧光探针具有式(1)所示的结构：

【技术特征摘要】
1.一种近红外半菁类荧光探针，其特征在于，所述近红外半菁类荧光探针具有式(1)所示的结构：2.权利要求1所述的近红外半菁类荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式(2)所示的化合物与环丙基甲酰氯接触；3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，相对于1毫摩尔的式(2)所示结构化合物，所述环丙基甲酰氯的用量为1-2毫摩尔，所述缚酸剂的用量为1-3毫摩尔，所述有机溶剂的用量为20-30毫升。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述缚酸剂选自三乙胺、二乙胺、二异丙基胺、吡啶、N,N-二甲氨基吡啶、2,6-二甲基吡啶、碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种；所述有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、四氯化碳、乙腈、丙酮、乙二醇二甲醚、N,N-二甲基甲酰胺和1,2-二氯乙烷中的至少一种。5.根据权利要求2-4中任意一项所述的制备方法，其中，所述亲核反应条件包括：温度为零下5℃至30℃，时间为10-120m...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光富，杨文超，杨庶侯，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42