【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种hppd蛋白、基因、载体、细胞、组合物及其应用、提高作物除草剂抗性的方法。
技术介绍
1、hppd是非血红素铁、α-酮酸依赖型加氧酶家族的一个成员，是酪氨酸代谢路径中的关键酶，能够将酪氨酸氨基转移酶的催化产物对羟苯基丙酮酸进一步催化生成尿黑酸。
2、在植物体内，尿黑酸是生物合成质体醌和生育酚的前体物质。质体醌不仅是八氢番茄红素去饱和酶的关键辅助因子，还是电子传递的载体，直接参与到光合作用中。而生育酚是细胞膜的结构组分之一，是细胞膜的抗氧化剂。一旦hppd的活性被抑制，就会导致质体醌的合成减少，进而导致八氢番茄红素去饱和酶的催化过程受阻，从而影响类胡萝卜素的生物合成，最终使植物出现白化症状而死亡。所以，hppd是一个重要的除草剂作用靶标。
3、目前，商品化的hppd抑制剂除草剂已经有16余种。由于hppd除草剂具有广谱、高效、使用安全、抗性增长缓慢等特点，已经受到越来越多农药化学研究者的关注，并且其年销售额在逐年增长。
4、抗除草剂作物在过去20年里，给农民和环境带来了巨大的利益，例如，抗草甘膦玉米和大豆作物等。因此，开发新的抗除草剂作物，如抗hppd抑制剂类除草剂的作物，显得非常必要。
5、本领域已有一些对hppd除草剂抗性基因的研究，这些研究大多是以来自各种菌的hppd为研究对象，寻找其对除草剂具有抗性的突变位点，再将该外源突变基因导入经济作物体内以增强其对除草剂的耐受性。但是，以经济作物本身的hppd蛋白为研究对象，在不改变其正常的催化功
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的上述缺陷，提供对hppd抑制剂具有抗性的hppd蛋白及其编码基因及其应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，该蛋白具有选自以下至少一种的氨基酸序列：
3、(1)如seq id no:1所示的氨基酸序列中选自418位点、423位点和432位点中的至少一个位点发生突变后衍生的第一氨基酸序列；
4、(2)所述第一氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第一氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第一氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
5、(3)如seq id no:2所示的氨基酸序列中422位点发生突变后衍生的第二氨基酸序列；
6、(4)所述第二氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第二氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第二氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
7、(5)如seq id no:3所示的氨基酸序列中426位点发生突变后衍生的第三氨基酸序列；
8、(6)所述第三氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第三氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第三氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
9、(7)如seq id no:4所示的氨基酸序列中418位点发生突变后衍生的第四氨基酸序列；
10、(8)所述第四氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第四氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第四氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
11、(9)如seq id no:5所示的氨基酸序列中426位点发生突变后衍生的第五氨基酸序列；
12、(10)所述第五氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第五氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第五氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质。
13、本专利技术第二方面提供一种编码对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的基因，该基因的核苷酸序列为能够编码前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
14、本专利技术第三方面提供一种重组载体，该重组载体含有前述第二方面所述的基因。
15、本专利技术第四方面提供一种转基因细胞，该转基因细胞含有前述第二方面所述的基因。
16、本专利技术第五方面提供一种组合物，该组合物含有前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白。
17、本专利技术第六方面提供前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白、前述第二方面所述的基因、前述第三方面所述的重组载体、前述第四方面所述的转基因细胞中的至少一种在提高作物除草剂抗性中的应用。
18、本专利技术第七方面提供一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：将前述第三方面所述的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
19、本专利技术第八方面提供一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：通过杂交、转育或回交，将含有前述第三方面所述的重组载体的突变作物中的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
20、本专利技术第九方面提供一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：通过crispr/cas基因编辑方法对目标植物的hppd基因进行改造，使得目标植物表达前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
21、与现有技术相比，本专利技术提供的对hppd抑制剂具有抗性的hppd蛋白及其编码基因至少具有如下优势：
22、通过将编码本专利技术提供的基因转入目标植物中，能够使得目标植物获得对hppd抑制剂(除草剂)的抗性，但酶本身的催化活性基本不受影响。因此，本专利技术提供的hppd蛋白及其编码基因能够用于培育具有除草剂抗性的植物。
23、本专利技术的其它特征和优点将通过随后的具体实施方式部分予以详细说明。
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1.一种对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如第三氨基酸序列所示；所述第三氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中426位点的谷氨酸突变为甲硫氨酸后的氨基酸序列。
2.一种编码对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为能够编码权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求2所述的基因。
4.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求2所述的基因；所述转基因细胞为原核细胞。
5.一种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白。
6.权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的转基因细胞中的至少一种在提高作物除草剂抗性中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述除草剂为HPPD抑制剂。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述除草剂为三酮类
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述除草剂为硝磺草酮、喹草酮、Y13287、Y18024和苯吡唑草酮中的至少一种。
10.一种提高作物除草剂抗性的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求3所述的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
11.一种提高作物除草剂抗性的方法，其特征在于，该方法包括：通过杂交、转育或回交，将含有权利要求3所述的重组载体的突变作物中的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
12.一种提高作物除草剂抗性的方法，其特征在于，该方法包括：通过CRISPR/Cas基因编辑方法对目标植物的HPPD基因进行改造，使得目标植物表达权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
...【技术特征摘要】
1.一种对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如第三氨基酸序列所示；所述第三氨基酸序列为如seq id no:3所示的氨基酸序列中426位点的谷氨酸突变为甲硫氨酸后的氨基酸序列。
2.一种编码对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为能够编码权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求2所述的基因。
4.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求2所述的基因；所述转基因细胞为原核细胞。
5.一种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白。
6.权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的转基因细胞中的至少一种在提高作物除草剂抗性中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述除草剂为hppd抑制剂。<...
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