结核分枝杆菌H37Rv编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种结核分枝杆菌H37Rv编码基因，其可用作结核分枝杆菌复合群分子鉴定的标准基因，用于结核分枝杆菌复合群的分子鉴定及临床检测。 1

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌H37Rv编码基因及其应用
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及对病原菌物种进行鉴定。
技术介绍
结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)是引起人类结核病的病原菌。可入侵全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病是至今极为重要的传染病，严重威胁人类生命健康。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。MTB的临床菌株难培养、生长缓慢、与其它分枝杆菌能交叉感染、结核病与其它呼吸道感染症状难区分等特征，给临床快速诊断和治疗带来了极大的困难。故建立快速、准确、特异、敏感、廉价的结核病检测方法，是有效治疗、控制结核病蔓延的必要前提，也是临床实验室分枝杆菌检测面临的新挑战和新任务。结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)，包括M.tuberculosis、M.africanum、M.orygis、M.bovis、M.microti、M.canettii、M.caprae、M.pinnipedii、M.suricattae、M.mungi等分枝杆菌类群，这些物种均会引起人和其它生命体结核病。目前国内外对MTBC的鉴定方法主要分为以下三类：传统分离培养法；分子水平检测(IS6110、限制性片段长度多态性分析、多位点可变数目重复片段多态性分析等)；菌体成分(脂肪酸、分枝菌酸)色谱分析方法。三类方法虽都有各自的优点，但也有不足之处，如传统分离培养周期长和菌体可培养率低；目前分子水平检测在特异性、灵敏性和简便性方面尚差些；菌体成分特性分析成本较高、操作复杂。MTBH37Rv于1998年完成全基因组测序，是最早完成全图测序的MTB菌株。自此，各国研究者们基于算法优化、注释软件更新、转录组学和蛋白质组学等策略，一直在完善、补充H37Rv基因注释数据库。然而，由于MTB属于原核生物，由于原核生物基因组注释技术本身的不足，在基因组注释中尚可能存在注释错误(过度注释、基因边界错误和ORF起始、终止位点错误、可变剪接、核糖体移位、漏注释)，给深入、准确解析生物学机制带来了困扰。为解决此难题，蛋白质基因组学(Proteogenomics)虽已被用于H37Rv已注释基因的校正，然而，高比例假阳性、常规技术难以进行注释基因预测、新基因验证、新基因功能分析及其应用等是该领域所面临的难题。总的来说，传统结核分枝杆菌复合群(MTBC)鉴定策略具有周期长、步骤繁琐、特异性和灵敏度不高等缺陷。为进一步完善对H37Rv全基因组重新注释，发现H37Rv中遗漏注释基因，确保H37Rv全基因组遗漏注释基因及其在MTBC分子鉴定中的应用技术得到有效保护，开发利用H37Rv新基因在MTBC类群中快速精准鉴别的方法势在必行。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种结核分枝杆菌H37Rv新的编码基因，该基因为H37Rv漏注释编码基因Rv2815A(+|3123619-3123756|)，其可用作结核分枝杆菌复合群条形码分子标记，用于检测结核分枝杆菌复合群，其序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的其他目的包括提供可用于扩增上述编码基因的特异性PCR引物以及提供一种检测或鉴定样品中是否存在结合分枝杆菌复合群的检测方法；本专利技术还提供与上述编码基因相关的检测试剂盒和上述基因的应用。根据本专利技术的一个方面，通过比较蛋白质基因组学研究技术，发现了H37Rv中一个难以被基因预测软件发现的蛋白编码序列，该基因能有效地将MTBC与同属的其它物种区分开来。该基因是一个结核分枝杆菌(MycobacteriumtuberculosisH37Rv)的遗漏注释基因，即Rv2815A(+|3123619-3123756|)，经NCBI-BLASTP后，数据库中没有比对到任何蛋白质注释信息。经比较基因组学研究发现该基因序列能将结核分枝杆菌复合群(MTBC)菌株与分枝杆菌属的其它种鉴别开来。具体地，设计能对MTBC的Rv2815A(+|3123619-3123756|)基因实现特异性扩增引物，即为本专利技术所提出的引物，引物序列为：F:5’-CAGCGTGTGGTAACAATGCC-3’；R:5’-AGCGATGCTGACGAAGGG-3’。根据待测样品中的该基因DNA序列PCR产物的有无或DNA序列的差异，可以快速准确鉴定MTBC。根据本专利技术的另一个方面，基于上述结核分枝杆菌H37Rv新的标准编码基因，本专利技术具体地建立了检测或鉴定结核分枝杆菌复合群的方法，步骤如下：(1)从待测样品中分离提取基因组DNA；(2)以步骤(1)获得的DNA为模板，采用下述引物进行PCR扩增：F:5’-CAGCGTGTGGTAACAATGCC-3’(SEQIDNO.4)；R:5’-AGCGATGCTGACGAAGGG-3’(SEQIDNO.5)。(3)对步骤(2)扩增得到的DNA产物进行凝胶电泳分析或进行测序；(4)将步骤(3)的结果与条形码基因Rv2815A(+|3123619-3123756|)进行比对，如果同源性大于99％，判定待测样品含有结核分枝杆菌复合群。进一步地，上述检测方法，根据DNA条形码原理，初步对PCR产物进行电泳分析，如果待测菌株没有目标条带，说明该菌株不是MTBC；如果有条带，则可进一步测序验证，将测序得到系列与H37Rv的Rv2815A(+|3123619-3123756|)的标准序列进行同源比较和比对，获得序列间的相似性，若序列同源性大于99％，即可判定菌株可能为MTBC；根据待鉴定鉴定菌株的DNA条形码序列与标准序列聚类情况来区分MTBC家族与非结核分枝杆菌、呼吸道常见病原菌及呼吸道常见病毒。该检测方法即可用于对结核分枝杆菌复合群的菌种鉴定研究，也可用于临床快速检验。待测样品可以是从H37Rv菌株、其它MTBC、非结核分枝杆菌、呼吸道常见病原菌、呼吸道常见病毒菌株；或者直接使用结核病和其它呼吸道患者痰液、唾液或者血液。在上述方法的基础上，本专利技术也提供检测试剂盒，试剂盒容器内装有用以检测结核分枝杆菌H37Rv新的标准编码基因的试剂，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中Rv2815A(+|3123619-3123756|)基因的试剂，例如可含有扩增引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、酶切反应和/或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述引物可以采用上述特异性PCR引物，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。本专利技术的编码基因的检测也可以以集成的例如基因芯片的方式提供。有益效果：本专利技术提供了一种用作结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法，该基因能有效地将MTBC与同属的其它物种区分开来，应用该基因的鉴定方法克服了现有结核分枝杆菌复合群鉴定过程中的引物设计多重性、结果重复性差等缺点，具有通用、易扩增、易比对的特点，可以准确地将该类群从亲缘关系很近的其它分枝杆菌或其它呼吸道感染病菌中鉴定出来，为结核流行病学调查及临床结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结核分枝杆菌H37Rv编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌H37Rv编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的结核分枝杆菌H37Rv编码基因，其特征在于所述基因编码如SEQIDNO.3序列所示的氨基酸。3.一种条形码分子标记，用作检测和/或鉴定结核分枝杆菌复合群，其包含作为标准检测基因的权利要求1所述的结核分枝杆菌H37Rv编码基因。4.一种特异性PCR引物，用于扩增权利要求1所述的结核分枝杆菌H37Rv编码基因。5.权利要求4所述的PCT引物，其特征在于，所述引物的序列为：F:5’-CAGCGTGTGGTAACAATGCC-3’；R:5’-AGCGATGCTGACGAAGGG-3’。6.一种结核分枝杆菌复合群鉴定的检测方法，包括如下步骤：(1)从待测样品中分离提取基因组DNA；(2)以步骤(1)获得的DNA为模板，加...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐平，张瑶，王富强，孙金帅，武舒佳，常蕾，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11