一种C2H2型转录因子基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种C2H2型转录因子基因asr1，其是在土生隐球酵母BSLL1‑1菌株中克隆的，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；本发明专利技术将带有潮霉素基因阻断的asr1重组片段导入土生隐球酵母中，土生隐球酵母asr1基因突变，突变菌株对多种离子胁迫的抗性增加，该突变菌株具有降低土壤中多种离子的应用潜力。 1

【技术实现步骤摘要】
一种C2H2型转录因子基因及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体地，涉及土生隐球酵母编码C2H2型转录因子基因的核苷酸序列和氨基酸序列，涉及含有该基因的同源重组质粒和含有该同源重组片段的突变菌株，它们的制备方法，以及它们在抵抗环境中离子胁迫中的应用。
技术介绍
逆境下植物细胞内常常靠积累无机离子来降低细胞内的渗透势，而根据植物种类的不同，植物体内积累和吸收的离子种类也不同，主要有K+、Na+、Ca2+、Mg2+等。而离子过多则会产生胁迫，离子胁迫会使植物产生营养亏损、呼吸受阻、渗透胁迫、生长减慢等问题。离子胁迫对植物整体发育的影响表现为缩短植物的生长周期，缩短植物的开花期，抑制植物器官和组织的生长，加速其发育进程。用NaCl处理过的植物幼苗，植物的干重、湿重，植株株高都会降低。盐胁迫对植物生理生化方面的影响主要体现在细胞脱水、膜结构和功能发生紊乱，细胞膜通透性发生改变。植物细胞质膜能维持其完整性和选择透过性，取决于细胞内外的一价离子(Na+，K+)和二价离子(Ca2+)之间的平衡，如果一方过量，会打破这个平衡，从而使细胞膜通透性发生改变。过量的Na+、Cl-和Ca2+渗入植物细胞内会导致植物细胞叶绿体受损，细胞光合强度降低。它在影响植物光合作用的同时也会影响其呼吸作用，在盐胁迫下，植物的呼吸作用先会增强，而后随着植物的生长而减弱。离子过多还会降低植物的物质代谢能力，造成一系列不良反应。土壤微生物是土壤生态体系的重要组成部分，在植物和土壤的相互作用过程中扮演着重要的角色。土壤微生物参与土壤养分转化、物质代谢、有机物分解、矿化以及污染物降解等多种生化反应。特别是，土壤微生物在土壤中污染物或者是重金属清除中发挥了重要作用，也即微生物修复技术。微生物修复技术是利用微生物（土著菌、外来菌、基因工程菌）对污染物的代谢作用而转化、降解污染物。微生物修复技术已成功应用于煤气厂址PAHs污染修复，石油烃污染土壤修复，农药污染土壤修复等。此外，重金属污染土壤的微生物修复主要是利用土壤中天然的微生物资源，削减、净化土壤中重金属或降低重金属毒性，从而使污染物的浓度降低到可以接受的水平，或将有毒有害的污染物转化为无害的物质，也包括将其稳定化以减少其向周边环境扩散。在重金属污染土壤的生态修复中微生物主要通过以下几种方式起作用：（1）通过微生物的吸附、代谢达到对重金属消减、净化作用和固定作用；（2）通过微生物改变重金属的化学形态，使重金属固定或生物可利用性降低，减少重金属的危害；（3）土壤微生物通过氧化还原作用改变根际重金属形态或产生的有机酸可增加金属的溶解性，提高重金属的有效性，以利于植物吸收；（4）通过促进植物生长，提高植物抗病性、抗逆能力等方式间接影响修复效率。微生物抵抗金属离子毒性的一个重要手段是通过细胞壁与细胞膜的膜表面富集作用。当环境中含金属离子浓度较高时，微生物会先摄取一定量的金属离子，刺激其体内的抗性机制表达，促进胞内过多的金属离子外排，或者使外界金属离子进入不了细胞内，以此来降低环境中金属离子对菌体产生的毒性。锌指基因广泛存在于生物体内，参与细胞分化、胚胎发育等相关基因的表达。根据半胱氨酸及组氨酸的数目不同，锌指蛋白分为很多亚型，其中最为广泛的是C2H2型锌指结构，它作为生物体内重要的转录因子可调控众多生理反应。对粗糙脉孢菌C2H2家族锌指转录因子基因敲除的57株突变株在以2％结晶纤维素为唯一碳源的培养条件下进行产纤维素酶水平分析,发现突变株在蛋白水平及内切β-1,4-葡聚糖酶酶活水平均比野生型有25％-77％不等的显著提高。运用Blastp比对并结合Pfam和SMART对烟草基因组数据库分析,鉴定了118条C2H2锌指蛋白家族成员，所有C2H2分为5个亚家族,同一亚家族成员之间在结构域和理化性质上呈现较高一致性，每个成员都含有C2H2结构域,在数量上存在较大差异。组织表达分析表明,每个C2H2亚家族都有成员在不同组织中表达,在叶及根中有些基因的表达量较高。C2H2型锌指蛋白参与基因表达调控的方式是识别并结合特异DNA片段，但具体是怎样识别和结合靶基因的还不完全清楚。对锌指蛋白-DNA复合物进行晶体结构分析，及应用定点突变技术来研究结构中具体是哪些氨基酸在识别并结合DNA中起重要作用，获得锌指蛋白中氨基酸与DNA中碱基相对应的识别码，从而为研究其调控基因表达方式奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种C2H2型转录因子asr1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质；其由土生隐球酵母（C.humicolus）BSLL1-1菌株产生，基因序列全长1872bp，编码C2H2型转录因子蛋白由623个氨基酸组成，分子量约为66kDa。本专利技术另一目的是将上述C2H2型转录因子基因asr1进行阻断获得的同源重组基因片段及包含该片段的重组质粒。本专利技术另一目的在于提供一种含有上述同源重组基因片段的土生隐球酵母突变菌株。本专利技术另一目的是将上述同源重组基因片段应用在增强微生物抗离子胁迫能力中。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：1、本专利技术提取从云南省保山市龙陵县周边茶园茶树根际酸性土壤中分离的土生隐球酵母BSLL1-1菌株基因组DNA，送上海人类基因组研究中心进行基因组测序，得到asr1基因序列。根据该序列设计引物，以土生隐球酵母cDNA为模板扩增asr1基因片段。将目的片段连接到pMD-18T载体上，得到含有目的片段的重组载体pMD18-T-asr1并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，涂布含氨苄青霉素的平板上，挑取阳性菌落测序，鉴定出编码Asr1蛋白的基因，其序列如SEQIDNO：1所示，该蛋白由623个氨基酸编码，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；2、asr1基因同源重组片段构建方法将asr1基因的前800bp、后872bp核苷酸和潮霉素基因三个独立片段分别设计扩增引物，前基因的反向引物与后基因的正向引物都带有一段同源臂；分别以asr1前臂和潮霉素基因为模板，扩增得到asr1前臂：潮霉素重组片段。以潮霉素基因与asr1后臂为模板，扩增得到潮霉素：asr1后臂重组片段。然后以上述两个重组片段为模板进行重叠延伸PCR，得到asr1前臂：潮霉素基因：asr1后臂片段，命名为asr1F：hyg：asr1R。3、本专利技术将得到的asr1前臂：潮霉素基因：asr1后臂重组片段asr1F：hyg：asr1R连接到pMD18-T载体上得到质粒pMD18-asr1:hyg并对其进行测序；在土生隐球酵母感受态细胞中加入测序正确的重组片段asr1F：hyg：asr1R，然后进行电击转化，将混合液涂于含200μg·mL-1潮霉素的GM平板上筛选发生同源重组的克隆；从潮霉素平板上挑取单菌落，用PCR和real-timePCR方法检测敲除是否成功。4、本专利技术比较了土生隐球酵母野生型菌株与突变型菌株在多种离子胁迫处理下的生长。配制YPD固体培养基，使各离子终浓度如下：Ca2+50mmol/L，Mn2+7.5mmol/L，Mg2+300mmol/L，Na+0.8mol/L，K+0.8mol/L。将野生型酵母和突变酵母接种到YPD液体培养基中摇床培养过夜。按1%接种量转接至新鲜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种C2H2型转录因子基因

【技术特征摘要】
1.一种C2H2型转录因子基因asr1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质。2.对权利要求1所述的C2H2型转录因子基因asr1进...

【专利技术属性】
技术研发人员：年洪娟，李定华，文增叶，刘帅，代梦瑶，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53