一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法技术

一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法，本发明专利技术之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌

A compound three toxin with antitumor activity and its preparation method

A three element compound toxin with antitumor activity and its preparation method. The present invention has a three meta compound toxin with antitumor activity. The encoding gene is derived from the symbiotic pathogenic bacilli of entomopathogenic nematode

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法
本专利技术涉及一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法。
技术介绍
根据世界卫生组织统计，全世界有3/5的人死于恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系统疾病这4大类疾病，而恶性肿瘤则是最主要的死因之一。微生物来源的抗肿瘤活性成分结构新颖、作用机制独特，具有很好的发展潜力。夏立秋等分离到一株具有肿瘤靶向性的昆虫病原线虫共生致病杆菌XenorhabdusstockiaeHN_xs01(CCTCCNO:M2012069)，从中分离到了四种具有抗肿瘤活性的次级代谢产物——长沙霉素A、长沙霉素B、长沙霉素C、长沙霉素D；在进一步研究X.stockiaeHN_xs01中抗肿瘤活性物质时，筛选到一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素。该三元复合毒素与细菌中普遍存在的SrfABC毒素具有同源性。目前，已有研究报道主要集中在SrfABC类毒素的所在基因岛序列特点、毒素表达调控研究上，有关SrfABC类毒素的认识还存在较大的分歧、矛盾性观点较多；而关于SrfABC毒素的抗肿瘤活性没有相关研究和报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是，克服现有技术的不足，提供一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素及其制备方法。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是，本专利技术之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌XenorhabdusstockiaeHN_xs01(CCTCCNO:M2012069)(参见CN103074282A)，为xsrfABC基因(即SrfABC毒素基因)，xsrfABC基因包含三个开放阅读框(ORF)：xsrfA(1395bp)、xsrfB(3021bp)和xsrfC(2682bp)。xsrfA的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，xsrfB的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示，xsrfC的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。SEQIDNO:1xsrfA：SEQIDNO:2xsrfB：SEQIDNO:3xsrfC：本专利技术之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素(XSrfABC)的氨基酸序列，xsrfA基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQIDNO:4所示，xsrfB基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQIDNO:5所示，xsrfC基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQIDNO:6所示。xsrfA编码产物XSrfA由464个氨基酸组成，xsrfB编码产物XSrfB由1006个氨基酸组成，xsrfC编码产物XSrfC由893个氨基酸组成。SEQIDNO:4XSrfA：SEQIDNO:5XSrfB:SEQIDNO:6XSrfC：本专利技术还包括序列表SEQIDNO:4-6所示的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列。通过实验发现，XSrfABC复合毒素对肿瘤细胞具有很好的抑制效果。本专利技术之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素的制备方法：首先我们提取了XenorhabdusstockiaeHN_xs01的基因组，构建了基因组fosmid文库，筛选对Hela细胞具有毒性的克隆子，对克隆子进行测序分析，将xsrfABC基因克隆获得表达载体pSC101-BAD-xsrfABC，将表达载体转化入GB05，得到重组菌株GB05(XSrfABC)，诱导表达XSrfABC毒素。可测定对肿瘤细胞的毒性(参见图1)。(从XenorhabdusstockiaeHN_xs01的基因组fosmid文库中筛选到xsrfABC基因，将xsrfABC基因诱导表达得到复合毒素)。本专利技术中，GB05(XSrfABC)重组菌株经诱导后，提取全蛋白对肿瘤细胞Hela、B16进行毒性检测。与空白对照相比，诱导后全蛋白对细胞的影响更为明显，特别是诱导4h全蛋白造成细胞形态变圆，伪足消失，细胞结团，细胞贴壁性降低，细胞数目减少，说明诱导后全蛋白有明显的细胞毒性。说明XSrfABC毒素对肿瘤细胞具有很好的毒性。此外，本专利技术通过原核表达、纯化制备XSrfABC毒素，提供了一种新型的、细菌来源的抗肿瘤活性物质。XSrfABC毒素对正常细胞——人脐静脉内皮细胞(HUVEC)没有毒性。本专利技术之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，还可以采用以下方法制备：(将三个基因片断分别表达三种蛋白，再收集，即得到复合毒素)为了制备XSrfABC毒素，我们分别构建了XSrfA、XSrfB和XSrfC的原核表达载体，诱导表达复合毒素的各组分，并利用亲和层析纯化毒素蛋白，将三种组分混合后以Hela细胞为靶标进行细胞毒性测定。具体过程：PCR分别扩增xsrfA、xsrfB和xsrfC基因片段，并克隆到表达质粒pGEX-4T-2，获得三个重组质粒：pGEX-4T-srfA，pGEX-4T-srfB，pGEX-4T-srfC(参见图2)。将三个重组质粒分别电转至E.coliBL21中，获得重组菌株BL21-SrfA、BL21-SrfB、BL21-SrfC。三种重组菌株经IPTG诱导后，均表达可溶性的目的蛋白。将三种可溶性表达蛋白的菌体上清用0.22μm滤膜过滤，用清洗缓冲液清洗GST琼脂糖树脂，加入蛋白裂解液，加入5倍柱体积的洗涤缓冲液洗脱蛋白，重复洗脱一次，加入2倍柱体积Elutionbuffer洗脱，收集蛋白，SDS-PAGE检测所纯化蛋白的纯度(参见图3)。分别表达再收集的复合毒素。诱导后复合毒素对肿瘤细胞有明显的细胞毒性。但对正常细胞——人脐静脉内皮细胞(HUVEC)没有毒性。微生物来源说明昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01(XenorhabdusstockiaeHN_xs01)；于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国·武汉·武汉大学)保藏，菌种保藏编号为CCTCCNO：M2012069。(参见CN103074282A)附图说明图1为表达质粒pSC101-BAD-xsrfABC示意图；图2为表达质粒pGEX-4T-xsrfA、pGEX-4T-xsrfB、pGEX-4T-xsrfC示意图；图3为毒素蛋白XSrfA、XSrfB、XSrfC可溶性表达及纯化检测图；图4为毒素蛋白XSrfABC对Hela细胞的毒性；图中，A，对照(PBS处理肿瘤细胞)；B～F，实验组(毒素蛋白XSrfABC的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)；图5为毒素蛋白XSrfABC对B16细胞的毒性；图中，A，对照(PBS处理肿瘤细胞)；B～F，实验组(毒素蛋白XSrfABC的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)；图6为毒素蛋白XSrfABC对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的毒性；图中，A，对照(PBS处理人脐静脉内皮细胞细胞)；B～F，实验组(毒素蛋白XSrfABC的浓度分别为50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl)。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例1本实施例之具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌XenorhabdusstockiaeHN_xs01(CCTCCNO:M2012069)(参本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其特征在于，其编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌Xenorhabdus stockiae HN_xs01，为xsrfABC基因，xsrfABC基因包含三个开放阅读框：xsrfA、xsrfB和xsrfC，xsrfA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，xsrfB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，xsrfC的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其特征在于，其编码基因来源于昆虫病原线虫共生致病杆菌XenorhabdusstockiaeHN_xs01，为xsrfABC基因，xsrfABC基因包含三个开放阅读框：xsrfA、xsrfB和xsrfC，xsrfA的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，xsrfB的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示，xsrfC的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的三元复合毒素，其特征在于，xsrfA基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQIDNO:4所示，xsrfB基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQIDNO:5所示，xsrfC基因编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQIDNO:6所示。3.根据权利要求1或2所述的具有抗肿瘤活性的三元复合毒素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先我们提取了XenorhabdusstockiaeHN_xs01的基因组，构建了基因组fosmid文库，筛选对Hela细胞具有毒性的克隆子，对克隆子进行测序分析，将xsrfABC基因克隆获得表达载体pSC101-BAD-xsrfABC，将表达载体转化入GB05，得到重组菌株GB05，诱导表达XSrfABC毒素。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡胜标，胡晓凤，谢亚丽，张国勇，杨曦，夏立秋，丁学知，彭智辉，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43