本发明专利技术公开了疏水蛋白mHGFI基因及表达的蛋白及应用，疏水蛋白mHGFI基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2表示。本发明专利技术采用大肠杆菌的表达系统，利用基因工程的方法对原有的灰树花菌(Grifola frondosa)HGFI基因中半胱氨酸进行突变为丝氨酸，获得高表达、表达的疏水蛋白溶解性好以及生产周期短的疏水蛋白mHGFI基因，实验表明，1L的TB培养基可以得到2mg目的蛋白mHGFI。疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白具有与真菌疏水蛋白HGFI相近的双亲性及应用性质。仍然可以作为乳化剂使小油滴在水中稳定存在，并且可以作为分散剂分散石墨烯及碳纳米管，解决疏水性材料修饰问题。
Hydrophobin mHGFI gene and expression protein and its application
The present invention discloses a hydrophobic protein mHGFI gene and its expressed protein and its application. The nucleotide sequence of the hydrophobic protein mHGFI gene is expressed as SEQ ID ID NO.2. The present invention uses the expression system of Escherichia coli to make the mutation of cysteine in the original Grifola frondosa HGFI gene to serine by genetic engineering, and obtain a hydrophobic egg white mHGFI gene with high expression, good hydrophobicity and short production cycle. The experiment shows that the TB medium of 1L is found. The 2mg target protein mHGFI can be obtained. The hydrophobin mHGFI gene has a dual affinity and application properties similar to that of the fungal hydrophobic protein HGFI. It can still be used as emulsifier to make small oil droplets stable in water, and can be used as dispersant to disperse graphene and carbon nanotubes to solve the modification of hydrophobic materials.
【技术实现步骤摘要】
疏水蛋白mHGFI基因及表达的蛋白及应用
本专利技术属于蛋白的基因工程及其性质研究，具体地涉及疏水蛋白突变体生产工艺及其应用。
技术介绍
疏水蛋白是由丝状真菌表达的一组小的(100-150个氨基酸)富含半胱氨酸的蛋白质。疏水蛋白是真菌独特的蛋白质，不会出现在其他生物体中。它们以其在物体表面上形成疏水性(防水)涂层的能力而闻名，于1991年首次被发现和分离，并且这些疏水蛋白都在氨基酸链保守位置存在8个半胱氨酸。这类蛋白质具有很高的表面活性，能够通过自组装在两相界面处形成两性蛋白膜，从而改变原介质表面的亲/疏水性。同时疏水蛋白具有广泛的应用性质，疏水蛋白可以作为洗洁产品的成分，改善食品对抗相变的能力并形成稳定的泡沫,还可以用于促进土壤中的污染物降解和应用在石油泄漏后的回收石油过程中；真菌疏水蛋白膜在不同条件下，如宽范围的pH值非常稳定，且可有效防止电极表面的氧化，使亲水性的电活性材料能够结合至电极表面。基于这些优势，真菌疏水蛋白可以作为一种电极基质或作为固定电活性分子至电极表面的材料。根据亲水模式和理化特性的差异，可将其分为两类：I型和II型。I类单层含有与淀粉样原纤维相同的核心结构，并且对刚果红和硫代黄素T呈阳性。由于I类疏水蛋白形成的单层具有高度有序的结构，单层组装涉及单体的大的结构重排,其自我装配形成的蛋白膜具有高度的不溶解性。即使在100℃水浴时也难溶解于2％SDS(十二烷基硫酸钠)，仅在过氧甲酸和三氟乙酸(TFA)等极少数有机溶剂中解聚和溶解，所以从菌丝上提取I型疏水蛋白(例如HGFI)时还必须要使用强氧化性酸三氟乙酸。同时由于单层组装涉及单体的大的结构重排，对于I型疏水蛋白在两相界面形成双亲性蛋白膜要比II疏水蛋白(例如HFBI，HFBII)有更好的稳定程度。目前对与疏水蛋白的生产主要利用真菌表达系统(例如毕赤酵母)，但是利用真菌表达系统由于甲醇诱导等步骤使得真菌生产周期长，尤其对于生产疏水蛋白HGFI(HydrophobinI型)的平皿菌丝，生长周期最多达三周。并且菌丝产量较低，每克干菌丝中仅能提取到HGFI1mg左右。对于原核系统而言(例如大肠杆菌)操作简单，表达量高，但疏水蛋白的表达过程中由于蛋白折叠修饰等过程使得形成包涵体，进而涉及到包涵体的变性和复性操作，更加大了生产成本及生产周期，使得疏水蛋白的大规模生产纯化存在困难因此，亟需一种可以高表达、表达的疏水蛋白溶解性好以及生产周期短的表达I型疏水蛋白mHGFI的基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种疏水蛋白mHGFI基因。本专利技术的第二个目的是提供疏水蛋白mHGFI基因表达的I型疏水蛋白mHGFI。本专利技术的第三个目的是提供疏水蛋白mHGFI的应用。本专利技术的技术方案概述如下：疏水蛋白mHGFI基因，该基因的核苷酸序列是SEQIDNO.2表示。疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白，该蛋白的氨基酸序列是SEQIDNO.4表示。疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白作为修饰疏水性物质的应用。本专利技术的优点：本专利技术采用大肠杆菌的表达系统，利用基因工程的方法对原有的灰树花菌(Grifolafrondosa)HGFI基因中半胱氨酸进行突变为丝氨酸，获得高表达、表达的疏水蛋白溶解性好以及生产周期短的疏水蛋白mHGFI基因，实验表明，1L的TB培养基可以得到2mg目的蛋白mHGFI。疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白具有与真菌疏水蛋白HGFI相近的双亲性及应用性质。仍然可以作为乳化剂使小油滴在水中稳定存在，并且可以作为分散剂分散石墨烯及碳纳米管，解决疏水性材料修饰问题。附图说明图1为mHGFI蛋白凝胶色谱层析检测实验。图2为mHGFI蛋白SDS-page胶检测实验。图3为HGFI及mHGFI蛋白乳化实验。图4为HGFI及mHGFI蛋白分散碳纳米管材料实验。图5为HGFI及mHGFI蛋白分散石墨烯材料实验。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。pET-28a为市售。实验材料：(1)LB培养基：配制每1L培养基，在1L的一次蒸馏水中加入蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，溶解后，121℃、0.1MPa灭菌20min。配置固体LB培养基时向培养基内补加1.5％的琼脂粉。(2)TB培养基：配制每900mL培养基，在900mL的一次蒸馏水中加入蛋白胨12g，酵母粉24g，NaCl8g，甘油4ml，溶解于2L锥形瓶，121℃、0.1MPa灭菌20min。用90ml去离子水溶解2.31gKH2PO4和12.54gK2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至100ml，121℃、0.1MPa灭菌20min。等待其两者温度降低到常温，在超净台中将两者混匀至上述2L锥形瓶。(3)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)30％丙烯酰胺溶液(100mL)：将30g丙烯酰胺与0.8g的甲叉双丙烯酰胺溶解在100mL的双蒸水中，溶解后放置于4℃棕色瓶内。1.5MTris-HClpH＝8.8缓冲液(1L)：称取181.71gTris溶解在800mL纯水中，调pH至8.8，定容至1L，室温保存。0.5MTris-HClpH＝6.8缓冲液(500mL)：称取60.57gTris溶解在400mL纯水中，调pH至6.8，定容至500mL，室温保存。10％十二烷基硫酸钠(10％SDS)溶液(50mL)：称取5gSDS，加纯水至50mL，室温保存。10％过硫酸铵(10％APS)溶液(20mL)：称取2g过硫酸铵，加纯水至20mL，每管500μL分装，-20℃保存备用。表112％SDS-PAGE分离胶配制(10mL)表2SDS-PAGE浓缩胶配制(5mL)(4)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(5L)：称取75.5gTris，470g甘氨酸，25gSDS，加纯水溶解，定容至5L。(5)6×蛋白上样缓冲液：0.35MpH＝6.8Tris-HCl，10.28％W/VSDS，36％甘油，5％β-巯基乙醇，0.012g/mL溴酚蓝，1mL每管分装，-20℃保存备用。(6)SDS-PAGE染色液(1L)：考马斯亮蓝R-2505g，无水乙醇450mL，冰醋酸100mL，水450mL，混匀备用。(7)SDS-PAGE脱色液：水、无水乙醇、冰醋酸按照6:3:1的比例混合均匀，备用。(8)1MDTT：首先配制pH5.2、0.01M的乙酸钠溶液20mL，称取3.09gDTT，将其溶解于乙酸钠溶液中，过滤除菌，每管分装成1mL，保存于-20℃备用。(9)卡那霉素(100mg/mL)：量取250mL双蒸水，121℃高压灭菌20min，25g卡那霉素加入双蒸水中，混匀，每管850μL分装，保存于-20℃。使用时将其稀释1000倍，终浓度为100μg/mL。(10)异丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG(1M)：IPTG分子量为238.31，以5g/瓶规格为例。配制1M的IPTG需要的双蒸水的量为21mL，于超净工作台中，将5g的IPTG粉末全部溶解在121℃高压灭菌20min的21mL双蒸水中，混合均匀，每管1000μL分装，保存于-80℃。(11)5×PBS：700mMNaCl，13.5mMKCl，50mMNa2HPO4，9mMKH2PO4(pH7.3)，0.22μm滤膜抽滤，4℃保存备用。本文档来自技高网...
【技术保护点】
疏水蛋白mHGFI基因，其特征是所述基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2表示。
【技术特征摘要】
1.疏水蛋白mHGFI基因，其特征是所述基因的核苷酸序列是SEQIDNO.2表示。2.疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：王泽方，王斌，程莹莹，刘成，杨海涛，陈卓芝，杨璐，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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