15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及病原体检测试剂，具体公开了15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒。本发明专利技术针对肺炎克雷伯菌，流感嗜血杆菌，化脓链球菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，肺炎衣原体，结核分枝杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，鲍曼不动杆菌，肺炎支原体，粪肠球菌，嗜肺军团杆菌，肺炎链球菌，绿脓假单胞菌和脓肿分枝杆菌的基因序列保守区域特异的靶序列，通过设计互相不存在交叉反应的引物和探针，既克服了针对不同病原菌的检测探针易产生相互影响或干扰的问题，又保证了不同引物和探针的组合和匹配，还可实现在相同温度下同时进行高效的特异性检测。

【技术实现步骤摘要】
15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒
本专利技术涉及病原体检测试剂，具体地说，涉及15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒。
技术介绍
在成年人和儿童中，发热伴呼吸道症候群是最普通的急性传染病，主要由多种病原体引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变，其中包括细菌、病毒、支原体、衣原体等。由于临床症状均表现为发热(体温≥38℃)，并伴有乏力、头痛、咳嗽、咽喉疼痛、全身酸痛等上呼吸道症状，对各种病原体的诊断需要大量的实验筛查，操作步骤繁琐、耗费时间较长，工作效率较低。目前，常见的社区性呼吸道感染病原体包括肺炎克雷伯菌，流感嗜血杆菌，化脓链球菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，肺炎衣原体，结核分枝杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，鲍曼不动杆菌，肺炎支原体，粪肠球菌，嗜肺军团杆菌，肺炎链球菌，绿脓假单胞菌，脓肿分枝杆菌。为提高临床检测效率，快速确认病原体，为后续的用药和治疗进行指导，急需更简便、更快速并且能够联合检测的方案。在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。然而，目前还没有可对以上15种病原菌进行同时PCR法检测，并保证检测准确性和特异性的有效方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合及试剂盒。为了实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术针对肺炎克雷伯菌，流感嗜血杆菌，化脓链球菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，肺炎衣原体，结核分枝杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，鲍曼不动杆菌，肺炎支原体，粪肠球菌，嗜肺军团杆菌，肺炎链球菌，绿脓假单胞菌和脓肿分枝杆菌的基因序列保守区域特异的靶序列设计引物和Taqman探针，之后经过严格筛选，获得一套互相不存在交叉反应的引物探针组合，可利用Real-timePCR的方法，快速联合检测样品中是否存在以上15种病原体的核酸。所述引物探针组合包括如下引物和探针：(1)肺炎克雷伯菌P1：5’-TGCCCACTTTGTTAACGCCT-3’；P2：5’-AGATAAAACGCCAGGCCAAGA-3’；探针1：5’-X1-CGGCGTGGGATTCGCTTTCGAGCCT-Y-3’；(2)流感嗜血杆菌P3：5’-CTGACCAGGTGCGTGATAGG-3’；P4：5’-CTGACCAGGTGCGTGATAGG-3’；探针2：5’-X2-TGCCCACCACGATCCGATTCCAC-Y-3’；(3)化脓链球菌P5：5’-CTAGGAGCACGGATTCCAGC-3’；P6：5’-CTAGGAGCACGGATTCCAGC-3’；探针3：5’-X3-TGCCCACCACGATCCGATTCCAC-Y-3’；(4)金黄色葡萄球菌P7：5’-TGTTATCCATCGCCTACGCC-3’；P8：5’-AGTGAGAATGCCGGTGTGAG-3’；探针4：5’-X4-TCGGCCTCAGCTTAGGACCCTAACCC-Y-3’；(5)大肠埃希菌P9：5’-TATCCTTTGTTGCCAGCGGT-3’；P10：5’-CGCTTCTCTTTGTATGCGCC-3’；探针5：5’-X1-CGGCCGGGAACTCAAAGGAGACT-Y-3’；(6)肺炎衣原体P11：5’-GTCCTTGCCGTAAACGATGC-3’；P12：5’-AGGTAAGGTCCTTCGCGTTG-3’；探针6：5’-X2-CCCCATCCGTGTCGGAGCTAACG-Y-3’；(7)结核分枝杆菌P13：5’-CGTAATAGGTGTCCGGCTCG-3’；P14：5’-TAAGGGGCCTTTTGACGGTG-3’；探针7：5’-X3-CGATCGGGGGCAAGTCATCGGC-Y-3’；(8)嗜麦芽窄食单胞菌P15：5’-TGCGCTTTAATTGCTGCGTT-3’；P16：5’-CAGGGCATGTTTTCTGGCAC-3’；探针8：5’-X4-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTG-Y-3’；(9)鲍曼不动杆菌P17：5’-AGGGCCATGATGACTTGACG-3’；P18：5’-TCGTGTCGTGAGATGTTGGG-3’；探针9：5’-X1-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGY-3’；(10)肺炎支原体P19：5’-CAATTGTTGCTGGTGCCCTC-3’；P20：5’-CCGGAGATCAGAGCGTTACC-3’；探针10：5’-X2-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGG-Y-3’；(11)粪肠球菌P21：5’-GTTGGTGAGGTAACGGCTCA-3’；P22：5’-GTTGGTGAGGTAACGGCTCA-3’；探针11：5’-X3-AGCACGATGCATAGCCGACCTGAGA-Y-3’；(12)嗜肺军团杆菌P23：5’-CCGTCCGCTGACTGGATAAA-3’；P24：5’-ACAGACGGCAACTGGTACTG-3’；探针12：5’-X4-TGCTGCGGTACCCTGCGATTC-Y-3’；(13)肺炎链球菌P25：5’-TGCTAAGGGCAGTACGAACC-3’；P26：5’-GTTCGGTCAGTCGGATGTGG-3’；探针13：5’-X1-TGCAGAAGAACGGTTTAAGGAGCTGAGCTGGC-Y-3’；(14)绿脓假单胞菌P27：5’-AAGCCTATCGCAAGGCTGAC-3’；P2：5’-CCTATTACTTGCGGCTGGCT-3’；探针14：5’-X2-CTCTCGCTGCTCAGAAAGCTCAGCAGAC-Y-3’；(15)脓肿分枝杆菌P29：5’-ACAAGCGGTGGAGTATGTGG-3’；P30：5’-CCCAACATCTCACGACACGA-3’；探针15：5’-X3-TGGTTTGATCATGGCCGGAGGCGC-Y-3’；其中，上述探针中的X1、X2、X3和X4分别为不同的荧光基团，Y为淬灭基团。所述荧光基团可为FAM、Cy3、Cy5和Texasred等，淬灭基团可为BHQ1或TAMRA。实际运用中不限于以上所列的荧光基团种类，替换或者交换探针的荧光基团或者淬灭基团同样受到本专利技术的保护。在本专利技术的具体实施方式中，上述探针中的X1采用荧光基团FAM，X2采用荧光基团Cy3，X3采用荧光基团Cy5，X4采用荧光基团Texasred，Y采用淬灭基团BHQ1或TAMRA。本专利技术所提供的引物探针组合，可对以上15种常见呼吸道病原体进行同时检测，并表现为强特异性，且针对不同病原菌的检测引物探针不产生相互影响或干扰，保证了不同引物和探针组合的匹配，并可实现在相同温度下同时进行高效的特异性检测。基于上述技术方案，含有本专利技术所述引物探针组合的试剂也属于本专利技术的保护范围。在所述试剂的实际应用中，为了更好的确保检测的准确性，所述试剂中还引入了一套针对内参基因GAPDH设计的引物和探针：P31：5’-TTTGGCTACAGCAACAGGGT-3’；P32：5’-TT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合，其特征在于，包括如下引物和探针：(1)肺炎克雷伯菌P1：5’‑TGCCCACTTTGTTAACGCCT‑3’；P2：5’‑AGATAAAACGCCAGGCCAAGA‑3’；探针1：5’‑X1‑CGGCGTGGGATTCGCTTTCGAGCCT‑Y‑3’；(2)流感嗜血杆菌P3：5’‑CTGACCAGGTGCGTGATAGG‑3’；P4：5’‑CTGACCAGGTGCGTGATAGG‑3’；探针2：5’‑X2‑TGCCCACCACGATCCGATTCCAC‑Y‑3’；(3)化脓链球菌P5：5’‑CTAGGAGCACGGATTCCAGC‑3’；P6：5’‑CTAGGAGCACGGATTCCAGC‑3’；探针3：5’‑X3‑TGCCCACCACGATCCGATTCCAC‑Y‑3’；(4)金黄色葡萄球菌P7：5’‑TGTTATCCATCGCCTACGCC‑3’；P8：5’‑AGTGAGAATGCCGGTGTGAG‑3’；探针4：5’‑X4‑TCGGCCTCAGCTTAGGACCCTAACCC‑Y‑3’；(5)大肠埃希菌P9：5’‑TATCCTTTGTTGCCAGCGGT‑3’；P10：5’‑CGCTTCTCTTTGTATGCGCC‑3’；探针5：5’‑X1‑CGGCCGGGAACTCAAAGGAGACT‑Y‑3’；(6)肺炎衣原体P11：5’‑GTCCTTGCCGTAAACGATGC‑3’；P12：5’‑AGGTAAGGTCCTTCGCGTTG‑3’；探针6：5’‑X2‑CCCCATCCGTGTCGGAGCTAACG‑Y‑3’；(7)结核分枝杆菌P13：5’‑CGTAATAGGTGTCCGGCTCG‑3’；P14：5’‑TAAGGGGCCTTTTGACGGTG‑3’；探针7：5’‑X3‑CGATCGGGGGCAAGTCATCGGC‑Y‑3’；(8)嗜麦芽窄食单胞菌P15：5’‑TGCGCTTTAATTGCTGCGTT‑3’；P16：5’‑CAGGGCATGTTTTCTGGCAC‑3’；探针8：5’‑X4‑CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTG‑Y‑3’；(9)鲍曼不动杆菌P17：5’‑AGGGCCATGATGACTTGACG‑3’；P18：5’‑TCGTGTCGTGAGATGTTGGG‑3’；探针9：5’‑X1‑CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGY‑3’；(10)肺炎支原体P19：5’‑CAATTGTTGCTGGTGCCCTC‑3’；P20：5’‑CCGGAGATCAGAGCGTTACC‑3’；探针10：5’‑X2‑CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGG‑Y‑3’；(11)粪肠球菌P21：5’‑GTTGGTGAGGTAACGGCTCA‑3’；P22：5’‑GTTGGTGAGGTAACGGCTCA‑3’；探针11：5’‑X3‑AGCACGATGCATAGCCGACCTGAGA‑Y‑3’；(12)嗜肺军团杆菌P23：5’‑CCGTCCGCTGACTGGATAAA‑3’；P24：5’‑ACAGACGGCAACTGGTACTG‑3’；探针12：5’‑X4‑TGCTGCGGTACCCTGCGATTC‑Y‑3’；(13)肺炎链球菌P25：5’‑TGCTAAGGGCAGTACGAACC‑3’；P26：5’‑GTTCGGTCAGTCGGATGTGG‑3’；探针13：5’‑X1‑TGCAGAAGAACGGTTTAAGGAGCTGAGCTGGC‑Y‑3’；(14)绿脓假单胞菌P27：5’‑AAGCCTATCGCAAGGCTGAC‑3’；P2：5’‑CCTATTACTTGCGGCTGGCT‑3’；探针14：5’‑X2‑CTCTCGCTGCTCAGAAAGCTCAGCAGAC‑Y‑3’；(15)脓肿分枝杆菌P29：5’‑ACAAGCGGTGGAGTATGTGG‑3’；P30：5’‑CCCAACATCTCACGACACGA‑3’；探针15：5’‑X3‑TGGTTTGATCATGGCCGGAGGCGC‑Y‑3’；其中，上述探针中的X1、X2、X3和X4分别为不同的荧光基团，Y为淬灭基团。...

【技术特征摘要】
1.一种15种呼吸道感染病原体联检的引物探针组合，其特征在于，包括如下引物和探针：(1)肺炎克雷伯菌P1：5’-TGCCCACTTTGTTAACGCCT-3’；P2：5’-AGATAAAACGCCAGGCCAAGA-3’；探针1：5’-X1-CGGCGTGGGATTCGCTTTCGAGCCT-Y-3’；(2)流感嗜血杆菌P3：5’-CTGACCAGGTGCGTGATAGG-3’；P4：5’-CTGACCAGGTGCGTGATAGG-3’；探针2：5’-X2-TGCCCACCACGATCCGATTCCAC-Y-3’；(3)化脓链球菌P5：5’-CTAGGAGCACGGATTCCAGC-3’；P6：5’-CTAGGAGCACGGATTCCAGC-3’；探针3：5’-X3-TGCCCACCACGATCCGATTCCAC-Y-3’；(4)金黄色葡萄球菌P7：5’-TGTTATCCATCGCCTACGCC-3’；P8：5’-AGTGAGAATGCCGGTGTGAG-3’；探针4：5’-X4-TCGGCCTCAGCTTAGGACCCTAACCC-Y-3’；(5)大肠埃希菌P9：5’-TATCCTTTGTTGCCAGCGGT-3’；P10：5’-CGCTTCTCTTTGTATGCGCC-3’；探针5：5’-X1-CGGCCGGGAACTCAAAGGAGACT-Y-3’；(6)肺炎衣原体P11：5’-GTCCTTGCCGTAAACGATGC-3’；P12：5’-AGGTAAGGTCCTTCGCGTTG-3’；探针6：5’-X2-CCCCATCCGTGTCGGAGCTAACG-Y-3’；(7)结核分枝杆菌P13：5’-CGTAATAGGTGTCCGGCTCG-3’；P14：5’-TAAGGGGCCTTTTGACGGTG-3’；探针7：5’-X3-CGATCGGGGGCAAGTCATCGGC-Y-3’；(8)嗜麦芽窄食单胞菌P15：5’-TGCGCTTTAATTGCTGCGTT-3’；P16：5’-CAGGGCATGTTTTCTGGCAC-3’；探针8：5’-X4-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTG-Y-3’；(9)鲍曼不动杆菌P17：5’-AGGGCCATGATGACTTGACG-3’；P18：5’-TCGTGTCGTGAGATGTTGGG-3’；探针9：5’-X1-CGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGY-3’；(10)肺炎支原体P19：5’-CAATTGTTGCTGGTGCCCTC-3’；P20：5’...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：西安九安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11