一种鸽衣原体PCR诊断试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种本发明专利技术公开了一种鸽衣原体PCR诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、CPS‑F上游引物、CPS‑R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸽衣原体阳性质粒。本发明专利技术的鸽衣原体PCR诊断试剂盒敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸽衣原体感染提供有力的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种鸽衣原体PCR诊断试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，具体涉及一种鸽衣原体PCR诊断试剂盒及其检测方法。
技术介绍
鸽衣原体病是由鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophilapsittaci,Cps)感染鸽引起不同征候群的一种接触性传染病，临床上以肺炎、心包炎、气囊炎、结膜炎为特征，又称单眼伤风，是危害养鸽业比较严重的一种传染病。由于“母鸽到雏鸽”的传播循环的存在导致衣原体在鸽群中长期感染。衣原体随患病亲鸽的鼻分泌物、粪便、泪液、喙和咽喉的粘液、嗉囊乳等分泌物排出体外，幼鸽因吸入、吃或饮入污染的食物和饮水而感染。本病也可通过吸血昆虫叮咬感染，导致在宿主间进行传播。控制鸽衣原体病最佳办法就是早诊断，早处理，早治疗。PCR技术在动物疫病快速诊断中得到了广泛应用，目前尚未有诊断鸽衣原体的PCR诊断试剂盒，临床上无法快速诊断出鸽衣原体，检测周期长、成本高。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种鸽衣原体PCR诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制鸽衣原体感染提供有力的技术手段。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现。(一)一种鸽衣原体PCR诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAisoReagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、CPS-F上游引物、CPS-R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸽衣原体阳性质粒。优选的，所述CPS-F上游引物的序列为：5’-ATTTTCTGCACCTTAGGGGCAT-3’；所述CPS-R下游引物的序列为：5’-ATATTCAATCTGTAAGACAGG-3’。优选的，所述裂解液的成分为DNAisoReagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCRBuffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1CPS-F上游引物、25μmol·L-1CPS-R下游引物和5U/μLrTaqDNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为鸽衣原体阳性质粒，20个反应共计40.0μL，装成1管。(二)一种鸽衣原体PCR诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：步骤1，DNA提取子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管(EP管)，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；步骤2，PCR扩增反应子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物；子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述阴性对照样品提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行多个循环，最后再在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入鸽衣原体阳性质粒，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min、94℃反应50s、54℃反应60s、72℃反应60s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；步骤3，电泳检测通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断。优选的，子步骤1.1中，所述待检样品为组织病料样品、血清样品或泪液棉拭子样品。优选的，步骤2中，所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、CPS-F上游引物、CPS-R下游引物和rTaqDNA聚合酶。进一步优选的，所述CPS-F上游引物的序列为：5’-ATTTTCTGCACCTTAGGGGCAT-3’；所述CPS-R下游引物的序列为：5’-ATATTCAATCTGTAAGACAGG-3’。优选的，步骤2中，所述多个循环为35个循环。优选的，步骤3中，所述判断的标准为：阴性对照不出条带，阳性对照出458bp条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现458bp条带，即为鸽衣原体感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的鸽衣原体PCR诊断试剂盒采用PCR扩增，快速、特异性检测出鸽衣原体，为临床控制鸽衣原体感染提供有力的技术手段；检测总时间控制在2.5小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本专利技术能彻底解决鸽衣原体引起的感染的诊断问题，适合鸽场快速检测，亦适用于流行病学调查。本专利技术的提供了针对鸽衣原体的特异性引物，CPS-F/CPS-R为鸽衣原体特异性扩增引物组；利用其制成的试剂盒能快速、特异的检测出鸽衣原体，鸽衣原体出现458bp条带。本专利技术的鸽衣原体PCR诊断试剂盒能检测的极限为2.0×10-8pg·μL-1，表明本专利技术的鸽衣原体PCR诊断试剂盒的检测方法有很高的灵敏度，本专利技术的鸽衣原体PCR诊断试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。本专利技术提供的鸽衣原体PCR诊断试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本专利技术鸽衣原体PCR诊断试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本专利技术所得的鸽衣原体PCR诊断试剂盒实用性和适用性良好。附图说明下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。图1为本专利技术鸽衣原体PCR诊断试剂盒及其检测方法特异性试验电泳图；图中M为DL2000DNA分子质量标准，1为鸽疱疹病毒，2为鸽衣原体，3为传染性喉气管炎病毒，4为鸽痘病毒，5为鸽腺病毒，6为鸽支原体；图2为本专利技术鸽衣原体PCR诊断试剂盒及其检测方法灵敏度试验电泳图；图中M为DL2000DNA分子质量标准，1-10为鸽衣原体样品DNA梯度稀释，浓度范围为2.0×10-1pg·μL-1～2.0×10-10pg·μL-1；图3为本专利技术鸽衣原体PCR诊断试剂盒对部分临床样品电泳检测结果；图中M为DL2000DNA分子质量标准，1为阴性对照，2为阳性对照，3-12为部分组织病料、血清和泪液棉拭子样品的电泳检测结果。具体实施方式下面将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸽衣原体PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、CPS‑F上游引物、CPS‑R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸽衣原体阳性质粒。

【技术特征摘要】
1.一种鸽衣原体PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAisoReagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCRBuffer、dNTP、CPS-F上游引物、CPS-R下游引物和rTaqDNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为鸽衣原体阳性质粒。2.根据权利要求1所述的鸽衣原体PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述CPS-F上游引物的序列为：5’-ATTTTCTGCACCTTAGGGGCAT-3’；所述CPS-R下游引物的序列为：5’-ATATTCAATCTGTAAGACAGG-3’。3.根据权利要求1所述的鸽衣原体PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述裂解液的成分为DNAisoReagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCRBuffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1CPS-F上游引物、25μmol·L-1CPS-R下游引物和5U/μLrTaqDNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为鸽衣原体阳性质粒，20个反应共计40.0μL，装成1管。4.一种鸽衣原体PCR诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：步骤1，DNA提取子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管(EP管)，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；步骤2，PCR扩增反应子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱小甫，吴旭锦，
申请(专利权)人：咸阳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61