检测调节肥胖症蛋白作用的化合物的方法技术

一种检测模拟、增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物的方法，该方法包括： （ａ）针对模拟肥胖症蛋白生理作用的化合物，评估该化合物对肥胖症蛋白激活的信号转导物和与报道基因偶联的转录激活剂（ＳＴＡＴ）ＤＮＡ反应元件的作用；或 （ｂ）对增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物，评估该化合物对由肥胖症蛋白提供的、对于与报道基因偶联的肥胖症蛋白激活的ＳＴＡＴＤＮＡ反应元件的反应的作用； 反应元件和报道基因在肥胖症蛋白反应细胞系中表达。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新方法，更具体说涉及一种检测模拟、增强或抑制肥胖症蛋白(ob protein)的生理作用的化合物的方法。肥胖症蛋白(即leptine)是作为从脂肪组织到其他器官的信号以调节体重和能量平衡的一种分泌激素(Zhang等，Nature，1994，372，425)。具推测肥胖症蛋白还在造血和生殖功能中起作用(Cioffi等，NatureMedicine，1996，2(5)，585)。含有一个包括四个α螺旋，形成一束具有上上下下up-up-down-down)拓扑结构的核心的蛋白质分子包括细胞因子和生长因子的一个家族。这个家族的蛋白质引起已知激活导致基因转录的激酶级联反应的膜受体同型-和异型-寡聚合反应。被寡聚合反应激活的该家族受体分成两类；即如表皮生长因子类，它们在其细胞内的功能域具有完整的酪氨酸激酶活性(A.Ullrich & J.Schlessinger，Cell，1990，61，203-212)，以及如IL4和促红细胞生成素类，它们缺乏这种活性并通过一种结合的蛋白质酪氨酸激酶途径介导其反应(J.N.Ihle等，TIBS，1994，19，222-227)。两种受体亚型均受细胞因子激活，但4螺旋束蛋白只激活非完整酪氨酸激酶亚型。这种非完整蛋白质酪氨酸激酶受体一般通过与Janus激酶(JAK)以及这些受体结合的信号转导物和转录激活剂(STAT)蛋白有关的途径起作用。激活过程中，STAT蛋白结合到DNA反应元件上从而控制基因转录。包括一般序列TT(N)nAA的DNA调节元件的寡核苷酸序列已被鉴定为STAT反应元件(Seidel等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1995，92，3041)。在对信号分子如细胞因子起反应时，这些元件与STAT蛋白结合。在共同未决的联合王国专利申请号9509164.1中我们已经描述了我们的发现即肥胖症蛋白以四螺旋束三级结构为特征。现在我们认为肥胖症蛋白与激活JAK-STAT激酶级联反应的膜结合受体相互作用并由此构成用于检测模拟、增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物的分析系统的基础。这种检测在选择化合物以治疗体重、能量平衡、造血、生殖以及其他受“肥胖症蛋白”介导的疾病方面有用。该检测对选择化合物以治疗与肥胖、厌食、极度瘦弱和糖尿病有关的疾病特别有用。因此，本专利技术提供一种检测模拟、增强或抑制肥胖症蛋白生理作用的化合物的方法，该方法包括(a)针对模拟肥胖症蛋白生理作用的化合物，评估该化合物对与报道基因偶联的肥胖症蛋白激活信号转导物和转录激活剂(STAT)DNA反应元件的作用；或(b)对增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物，评估该化合物对由肥胖症蛋白提供的、对于与报道基因偶联的肥胖症蛋白激活的STATDNA反应元件的反应的作用；反应元件和报道基因在肥胖症蛋白反应细胞系中表达。该反应元件适合与报道基因，最好与小启动子偶联。一种适合的反应元件是核苷酸分子式TT(N)nAA，其中N是任何核苷酸并且n是4、5或6。由与其受体相互作用的肥胖症蛋白介导的细胞内事件选择性激活优选的反应元件。这种选择性反应元件可通过在用一些反应元件-报道基因构建体转染肥胖症反应细胞系时，检测受到肥胖症蛋白相对于其他细胞因子的相对激活作用来确定。优选反应元件是核苷酸分子式TT(N)nAA，其中N是任何核苷酸且n是5。进一步适合的反应元件是TTCCCGGAA。进一步适合的反应元件是受肥胖症蛋白调节的基因的启动子区，它是STAT相互作用所需要的。该基因取决于通过此检测选择的化合物的具体治疗用途。适合的报道基因是萤火虫荧光素酶或氯霉素乙酰转移酶。适合的启动子是小启动子如单纯疱疹病毒胸苷激酶或SV40启动子。“肥胖症反应的”细胞系的一个实例是肝或肝癌衍生的细胞系。肝或肝癌细胞系从American Type Culture Collection(ATCC)或EurpeanCollection of Animal Cell Cultures(ECACC)获得。这类细胞系的一个实例是Hep G2(人肝细胞癌)从ATCC(HB8065)获得。该Hep G2细胞系通过美国专利4393133公开并提出权利要求的。进一步的“肥胖症反应的”细胞系实例是大鼠-1成纤维细胞(Kroder等，Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes，1996，104(suppl2)，66)。大鼠1成纤维细胞系从ATTCC(CRL-2210)获得。可用置换结合检测鉴定其他反应细胞系。虽然结合可能不是受体功能的持久形式，它是将信号传递到细胞质的形式。可通过PCR或Northern印迹分析(例如人肥胖症蛋白Tartaglia等，Cell，1995，83，1263)鉴定受体功能的持久形式。最终通过监测leptin以不同浓度存在时的细胞活动检测反应细胞。鉴定侯选细胞系或监测这些细胞活动的可能方法包括如下方法1.微生理测量仪(Microphysiometer)这种方法检测细胞内生物化学变化所导致的pH的微小变化。受刺激时肥胖症蛋白反应细胞可经历生物化学变化从而引起细胞外酸化速率的微小改变，酸化速率可通过硅氧烷微生理测量仪检测。该微生理测量仪生物传感器方法已由McConnell，Science，1992，257，1906中做了综述。2.电泳迁移率移位检定(EMSA)将来自用肥胖症蛋白处理过的细胞的核提取物与含混杂的或专一的STAT反应元件DNA序列相混合。来自对肥胖症蛋白起反应的细胞的提取物可引起SATA反应元件寡核苷酸凝胶移位。参见书“重组DNA”，第二版，Watson等，1992，158页；Lamb等，Blood，1994，83，2063；3.蛋白质磷酸化检定测量法通过使用识别磷酸化酪氨酸的抗体可检定受体激活反应通过细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化与终反应的偶联。更具体说，由于leptin受体可刺激JAK/STAT途径的酪氨酸磷酸化，该方法提供了一种检测leptin反应细胞系的方法。专一性JAK/STAT抗体可与酪氨酸磷酸化抗体并列使用以检测leptin反应细胞系中的leptin激活。可能发生蛋白质磷酸化的抑制以及刺激。特别是，已在过表达(overpress)胰岛素受体的大鼠-1成纤维细胞中已经显示出由肥胖症蛋白产生的对肤岛素受体和胰岛素受体底物-1的胰岛素刺激的磷酸化过程中的抑制作用(Kroder等，1996，Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes，104，suppl 2，p66)。4.置换结合与放射标记的leptin，例如-leptin一起温浴细胞系后，可通过加入非标记的leptin研究与相对于非专一性结合的leptin的专一性结合。专一性/非专一的高比例结合提示该细胞系可能含有leptin受体。5.通过使用选择性抗体检测肥胖症蛋白受体的蛋白质功能形式，最好检测蛋白质的功能持久形式。6.通过Northen，RT-PCR或“狭缝印迹”分析检测肥胖症蛋白受体的mRNA功能形式，最好检测mRNA的功能持久形式。优选已知涉及控制那些正为之寻求化合物的特殊疾病状态方面的细胞系。从肝、脑或胰脏组织得到的细胞和成纤维细胞对适合于检定针对肥胖症和糖尿病的化合物的“肥胖症反应”细胞特别有用。脑的某些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：L·J·比莱，R·A·G·史密斯，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩比彻姆有限公司，
类型：发明
国别省市：