本发明专利技术公开了一种能够改变埃博霉素类化合物产生比例并且提高埃博霉素A产量的发酵用添加剂，该添加剂是2,3,5,6-四羟基-2-己烯酸-4-内酯，其在埃博霉素液体发酵培养基中的添加终浓度为100±15μmol/L。实验证实，本发明专利技术的添加剂能够保持金属离子和代谢中间产物的还原性，调节纤维堆囊菌的次级代谢流向，使埃博霉素A总量较未加添加剂时平均提高62％-105％，并且显著改变发酵液中埃博霉素A与B的比例，由未添加之前的1.83±0.16:1(埃博霉素A:B)改变为5.67±0.71:1(埃博霉素A:B)。本发明专利技术实现了发酵过程中埃博霉素类化合物的次级代谢流向和产物类型的调控，降低了埃博霉素A的发酵成本，为埃博霉素A的生产又提供了一种途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种发酵生产埃博霉素的添加剂及其应用，尤其设及一种能够改变埃 博霉素类化合物产生比例并且提高埃博霉素A产量的添加剂及其应用，属于抗肿瘤药物发 酵制备
技术介绍
促微管聚合类化合物紫杉醇（Paclitaxel，Taxo陆）及其类似物Docetaxel 灯粧妳解聽);是目前临床上最为成功的抗肿瘤化疗药物，被用于卵巢癌、胸腺癌、结肠癌、肺 癌和肝癌等实体癌的治疗，是美国FDA认定的实体瘤化疗的首选药物。在与紫杉醇具有相 同或相似生物学功能的天然化合物中，只有埃博霉素巧pothilones)来源于微生物纤维堆 囊菌的发酵产物，并且水溶性较紫杉醇大，细胞毒性更小，被认为是紫杉醇的更新换代产 品，是更好的抗癌药物。目前，已有多个埃博霉素类化合物进入了应用开发的不同阶段。2007年10月，第 一个埃博霉素类药物ix油epilone被美国食品药品管理局批准上市，并且还有六种埃博霉 素类化合物进入了临床试验：百美时施贵宝公司的BMS-310750 ;诺华公司的EP0906及其类 似物ABJ879 ;还有罗氏公司的K0S-862和K0S-1584 ;W及先灵公司的ZK-Epo。大量的临床 研究结果显示出该类化合物有极大的药用价值。 由于化学全合成步骤繁多，得率较低，与生物发酵法相比不具备成本优势，因此生 物合成法成为埃博霉素生产制备技术研究的主流方向。但是利用发酵添加物控制埃博霉素 的次级代谢流向，改变产物比例的研究较少。通过添加特定物质维持金属离子或者埃博霉 素合成中间产物的还原性，从而改变埃博霉素类化合物生物比例，特异性提高一种埃博霉 素化合物产量的专利文献至今仍未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种能够改变埃博霉素类化合 物产生比例并且提高埃博霉素A产量的发酵用添加剂。 本专利技术所述能够改变埃博霉素类化合物产生比例并且提高埃博霉素A产量的添 加剂，其特征在于：所述添加剂是2, 3, 5, 6-四径基-2-己締酸-4-内醋（即维生素C，又名 k抗坏血酸），其在埃博霉素液体发酵培养基中的添加终浓度为100 ± 15ymol/L。 进一步的，所述添加剂优选是2, 3, 5, 6-四径基-2-己締酸-4-内醋（即维生素C， 又名k抗坏血酸），其在埃博霉素液体发酵培养基中的添加终浓度为100ymol/L。 本专利技术所述能够改变埃博霉素类化合物产生比例并且提高埃博霉素A产量的添 加剂在发酵生产埃博霉素中的应用。 其中，所述发酵生产埃博霉素的方法是：将活化后的纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum)在添加有终浓度为100 + 15ymol/L(优选100ymol/L)的添加剂的埃博霉素 液体发酵培养基中，于pH7. 5、30 ± 2°C、200 ±lOrpm的条件下发酵培养9 ± 1天，获得含埃博 霉素的发酵液。 其中，所述埃博霉素液体发酵培养基简称为VCM培养基，其组分及含量为：± 豆淀粉8g/l，豆饼粉2.Ig/l，葡萄糖0. 9g/l，薦糖0. 5g/l，酵母粉0.6g/l，玉米浆1ml/ L，M拆〇4? 7&02. 5g/l，微量元素溶液 0. 5ml/l，CaClzlg/l，大孔吸附树脂XAD-1620血/ L;其中，所述微量元素溶液配方是：MnCl2'4H2〇100mg/l，CoCl220mg/l，CuS〇4lOmg/l， NazMoO* ? 2&0lOmg/L&1CI220mg/LLiCl5mg/LSnClz? 2&0 5mg/LH3BO3lOmg/L邸r 20mg/LKI20mg/L。 进一步的，所述纤维堆囊菌优选是纤维堆囊菌（Sorangiumcellulosum) S0OI57-2。 具体的，本专利技术所述添加剂在发酵生产埃博霉素中的应用方法是： (1)发酵菌株的选择：粘细菌菌株中的纤维堆囊菌（Sorangiumcellulosum) S0OI57-2。 (2)菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，3(TC培养7天，再接种至 液体培养基，30°C，200巧m培养5天。 然后将获得的菌液倒入含玻璃珠的转瓶中打散2分钟，备用。[001引其中， 所述固体平板培养基的成分为：KN03 0. 5g/l，胞2册〇4 0. 25g/l，1拆〇4 ? 7&0Ig/ L，FeCl30.Olg/L，微量元素溶液Iml/L，琼脂15g/L，抑7. 2(倒平板凝固后，贴1. 5X1. 5cm 的方形滤纸片）。 所述液体培养基的成分为：±豆淀粉8g/l，大豆蛋白腺2g/l，葡萄糖2g/l，酵母粉 2g/L，M拆〇4lg/L，CaCl2Ig/L，邸TA-Fe3+lml/L，微量元素溶液l.Oml/L，抑 7. 2。所述微量元素溶液配方是：MnClz? 4&0lOOmg/l，C0CI220mg/l，CuS〇4lOmg/l， NazMoO* ? 2&0lOmg/LSiClz20mg/LLiCl5mg/LSnClz? 2&0 5mg/LH3BO3lOmg/L邸r 20mg/l，KI20mg/L。 (3)发酵培养方式：取步骤（2)制得的菌液3mL分别接种至含有浓度为10iiM， 100yM和1000yM添加剂的VCM培养基中，于抑7. 5, 30 ± 2°C，200 ± 10巧m的条件下发酵培 养。 (4)埃博霉素的分离提取纯化：发酵9天后用80目筛网过滤收集检测量的树脂于 10ml离屯、管中，加入3ml甲醇过夜浸提。取1ml浸提液1200化pm，离屯、10分钟，过0.22ym 有机相滤器，HPLC检测。 (5)色谱检测条件：色谱柱：Shim-packMRC-孤S，4. 6mmX250mm 流动相：甲醇-水（体积比55:侣）流速：0. 7ml/min 紫外检测波长：249皿；进样量：10yL (6)根据吸收峰面积与埃博霉素浓度的关系曲线计算埃博霉素的产量，=组结果 取平均值并计算误差。 对比试验结果表明： 与普通培养基相比，使用含有本专利技术所述添加剂的液体发酵培养基，显著改变了 发酵液中埃博霉素A和埃博霉素B的产生比例。并且，与普通培养基相比，使用含有本专利技术 所述添加剂的液体发酵培养基，有效提高了埃博霉素A的产量。 具体的，埃博霉素产生差别如表1所示。 表1 :添加不同浓度的2, 3, 5, 6-四径基-2-己締酸-4-内醋时，埃博霉素产生情 况比较表 上表中结果显示2, 3, 5, 6-四径基-2-己締酸-4-内醋对于纤维堆囊菌产生埃博 霉素A有促进作用，并且显著改变了发酵液中埃博霉素A和埃博霉素B的产生比例。添加 100yM(终浓度）2, 3, 5, 6-四径基-2-己締酸-4-内醋时埃博霉素A的产量相对于对照提 高了 62%-105%，提高埃博霉素A发酵产量的效果比较显著；同时，埃博霉素A与B的产生 比例由空白对照的1. 83 + 0. 16:1 (埃博霉素A:B)改变为5. 67 + 0. 71:1 (埃博霉素A:B)。 过量添加1000yM(终浓度）2, 3, 5, 6-四径基-2-己締酸-4-内醋时，菌体生长受到抑制， 发酵液中无法检出埃博霉素A和B。 本专利技术公开一种能够改本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够改变埃博霉素类化合物产生比例并且提高埃博霉素A产量的添加剂，其特征在于：所述添加剂是2,3,5,6‑四羟基‑2‑己烯酸‑4‑内酯，其在埃博霉素液体发酵培养基中的添加终浓度为100±15μmol/L。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李越中，胡玮，郑连帅，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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