琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物及其用于蛋白质硝酰化的使用方法技术

本发明专利技术涉及琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物及合成此类化合物的方法。本发明专利技术还涉及琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物用于制备硝酰化蛋白质，例如硝酰化血红素蛋白(例如，硝酰化血红蛋白和硝酰化肌红蛋白)的用途。所述硝酰化蛋白质还任选地与聚环氧烷(PA0)，例如与聚乙二醇(PEG)偶联。聚硝酰化血红素蛋白用作携氧治疗剂(0TA)。本发明专利技术进一步涉及所述硝酰化蛋白质的药物组合物和使用硝酰化蛋白质治疗各种病状的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物及其用于蛋白质硝酰化的使 用方法
本专利技术总体上涉及琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物及合成琥珀酰亚胺活化型硝酰 化合物的方法。本专利技术还涉及琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物用于制备硝酰化蛋白质，例如 硝酰化血红素蛋白（例如，硝酰化血红蛋白和硝酰化肌红蛋白）的用途。所述硝酰化蛋白 质还任选地与聚环氧烷（PAO)，例如与聚乙二醇（PEG)偶联。聚硝酰化血红素蛋白用作携氧 治疗剂（OTA)并且能够输送分子氧、一氧化碳、一氧化氮及其混合物。因此，本专利技术进一步 包括所述硝酰化蛋白质的药物组合物和使用硝酰化蛋白质治疗各种病状的方法。 专利技术背景 早已将血红蛋白类氧载体（HBOC）与归因于血红素清除一氧化氮（NO)的血管 收缩联系起来。用作氧治疗剂（有时称为携氧血浆扩容剂）的氧载体，例如稳定血红蛋 白（Hb)，已经证实功效有限，这是因为它们清除了一氧化氮，引起血管收缩和高血压。在动 物和人类中，这些携氧溶液引起血管收缩的倾向可表现为高血压。虽然HBOC血管收缩效应 的根本机制不是很清楚，但是已经表明血红素铁可能迅速且不可逆地与内源N0, 一种强效 的血管扩张剂结合，从而引起血管收缩。 部分由于这些血管收缩效应，虽然包含经修饰无细胞Hb的产品已经是最有前景 的，但是至今尚无氧载体完全成功地用作携氧治疗剂（OTA)。美国军方已经研发了 α链与 双-二溴水杨酸-富马酸酯（a aHb)之间交联的人Hb，作为模型红细胞代用品，但是其在 表现出肺部和全身血管阻力严重增加后被放弃（Hess，J.等，1991，Blood 78 :356A)。这种 产品的商业形式在令人失望的III期临床试验后也被放弃（Winslow，R.M.，2000，Vox Sang 79 :1-20)。 在尝试克服Hb的NO结合活性中已经提出了两种分子方法。第一种方法使用远 端血红素口袋的定点诱变以试图产生NO结合亲和力降低的重组血红蛋白（Eich，R.F.等， 1996, Biochem. 35 :6976-83)。第二种方法使用化学改性法，其中通过寡聚化增大Hb的尺 寸，以试图降低或可能完全抑制Hb从血管间隙外渗到胞间隙（Hess，J. R.等，1978, J. Appl. Physiol. 74 :1769-78 ;Muldoon，S. M.等，1996, J. Lab. Clin. Med. 128 :579-83 ;Macdonald， V. W.等，1994, Biotechnology 22 :565-75 ;Furchgott, R. ,1984, Ann. Rev. Pharmacol. 24 : 175-97 ;和 Kilbourne，R.等，1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 199 :155-62)。 事实上，已经生成了在大鼠最大负载实验中血压不那么高，对NO的缔合结合率降 低的重组Hb(Doherty，D.H.等，1998，Nature Biotechnology 16 :672-676和Lemon，D.D.等 1996, Biotech 24:378)。然而，研究表明NO结合可能不是Hb血管活性的唯一解释。已 经发现，某些Hb大分子，例如经聚乙二醇（PEG)改性的Hb大分子，实际上没有血管收缩， 即使其NO缔合率与严重高血压α a Hb相等（Rohlfs，R. J.等1998, J Biol. Chem. 273 : 12128-12134)。此外，发现在出血之前作为交换输血给出时，PEG-Hb对预防出血后果非常 有效（Winslow，R. M.等 1998, J. Appl. Physiol. 85 :993-1003)。 PEG与Hb的偶联降低了其抗原性并且延长了其循环半衰期。然而，已经报道PEG 偶联反应导致Hb四聚体解离成α β -二聚体亚基，在接受Hb单体单元的PEG偶联物的交 换输血大鼠体内产生低于40, OOO道尔顿（Da）的总血色蛋白尿（Iwashita和Ajisaka Organ-Directed Toxicity ：Chem. Indicies Mech. , Proc. Symp. , Brown 等 1981 年编辑， Pergamon，Oxford，England，第 97-101 页）。由 Enzon，Inc.制备 了分子量大于 84, 000 道尔顿的聚环氧烷（PA0）偶联Hb(美国专利号5, 650, 388)，其携带了约10个拷贝的 PEG-5, 000链，在其α和ε-氨基处与Hb连接。将这种取代度描述为避免了哺乳动物中血 红蛋白尿相关的临床显著肾毒性。然而，偶联反应产生了异种偶联物群体并且含有必须通 过柱色谱法去除的其它有害反应物。 PEG偶联通常通过活化PEG部分与生物分子表面上官能团的反应进行。最常见的 官能团为赖氨酸的氨基、组氨酸残基的咪唑基和蛋白质的N末端；半胱氨酸残基的硫醇基； 及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基和所述蛋白质的C末端。通常通过将羟基末端转化 为能够在适度含水环境中与这些官能团反应的反应性部分活化PEG。用于偶联治疗性生物 药品的最常见单官能PEG之一是甲氧基-PEG (mPEG-ΟΗ)，其只有一个官能团（S卩，羟基）， 从而将双官能PEG相关的交联和聚集问题减到最少。然而，由于其生产工艺，mPEG-ΟΗ常常 受范围可高达10-15%的高分子量双官能PEG (即PEG二醇）污染（Dust J.M.等人1990， Macromolecule 23:3742-3746)。这种双官能PEG二醇具有约略为所需单官能PEG两倍的 尺寸。随着PEG分子量增加，污染问题进一步加重。mPEG-ΟΗ的纯度对PEG话生物治疗剂的 生产尤其重要，因为FDA在最终药物产品的生产工艺和质量方面要求有高水平的再现性。 已经在氧合和脱氧状态下进行了 Hb与PAO的偶联。美国专利号6, 844, 317描述 了在氧合或R状态下偶联Hb，通过在偶联之前用大气使Hb平衡以增强所生成的PEG-Hb 偶联物的氧亲和力。其他人描述了偶联之前为减弱氧亲和力并增加结构稳定性的的脱氧步 骤，使Hb能够经受住化学修饰、渗滤和/或无菌过滤和巴氏杀菌（pasteurization)的物理 应力（美国专利号5, 234, 903)。对于Hb的分子内交联，表明为使α-链的赖氨酸99暴露 于交联剂，可能需要在修饰之前使Hb脱氧（美国专利号5, 234, 903)。 Acharya等人研究了在与PEG偶联之前，用2-亚氨基硫烧硫醇化Hb的动力学（美 国专利号7, 501，499)。观察到，使亚氨基硫烷浓度从每个四聚体平均引入5个外来硫醇的 10倍增加到30倍几乎使Hb上的外来硫醇数量翻倍。然而，即使有双倍数量的硫醇，PEG偶 联后所见的尺寸增加只有少量。这表明在20倍摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000存在下 的偶联反应用较少反应性硫醇覆盖Hb表面，导致了抵御用更多反应性硫醇进一步修饰Hb 的立体干扰。因此，为达到经修饰Hb的所需偶联度（即6± 1个PEG/个Hb分子），Acharya 等人用8-15摩尔过量的亚氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种式(I)的硝酰化剂：其中：R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1‑C4烷基；X为氧、硫、氮、磷或硅；Y为CH2；n为0或1；并且m为0或1。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.03 US 61/619,783;2012.04.03 US 61/619,7681. 一种式⑴的硝酰化剂：其中： 札、R2、R3和R4的每一个独立地为c「c4烷基； X为氧、硫、氮、磷或硅； Y为CH2 ;n为0或1 ;并且 m为0或1。2. -种制备式（II)的硝酰化剂的方法包括使具有式（III)的化合物与N，N' -二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC)在有机碱的存在下反应； 其中&、R2、R3和R4的每一个独立地为烷基； X为氧、硫、氮、磷或硅； Y为CH2 ;并且m为0或1。3. -种制备式（IV)的硝酰化剂的方法包括使具有式（V)的化合物与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)在N，N' -二环己基碳二亚胺（DCC)的存在下反应； 其中 札、R2、R3和R4的每一个独立地为C「C4烷基； Y为CH2 ;并且m为0或1。4. 一种具有结构（VI)的硝酰化蛋白质：其中 Z表示所述蛋白质； 札、R2、R3和R4的每一个独立地为c「c4烷基； X为氧、硫、氮、磷或硅； Y为CH2 ;m为0或1 ; n为0或1 ; P为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数；并且N为所述蛋白质的氣。5. -种制备硝酰化蛋白质的方法，包括使所述蛋白质与式（II)的硝酰化剂反应其中 札、R2、R3和R4的每一个独立地为C「C4烷基； X为氧、硫、氮、磷或硅； Y为CH2 ;并且m为0或1。6. -种制备硝酰化蛋白质的方法，包括使所述蛋白质与式（IV)的硝酰化剂反应：其中&、R2、R3和R4的每一个独立地为烷基； Y为CH2 ;并且m为0或1。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的硝酰化剂、硝酰化蛋白质或方法，其中札、1?2為和 r4的每一个均为-ch3。8. 根据权利要求1或7所述的硝酰化剂，其中n为1。9. 根据权利要求8所述的硝酰化剂，其中X为氧或硫。10. 根据权利要求8所述的硝酰化剂，其中X为氧。11. 根据权利要求8所述的硝酰化剂，其中X为氧并且&术為和&的每一个均为-洱。12. 根据权利要求1或7所述的硝酰化剂，其中n为0。13. 根据权利要求1-12中任一项所述的硝酰化剂、硝酰化蛋白质或方法，其中m为0。14. 根据权利要求1-12中任一项所述的硝酰化剂、硝酰化蛋白质或方法，其中m为1。15. 根据权利要求1所述的硝酰化剂，其选自由以下组成的组：16.根据权利要求1所述的硝酰化剂，其中所述硝酰化剂为：17. 根据权利要求2、7、13和14中任一项所述的方法，其中所述有机碱包括三乙胺 (TEA)、N，N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N-甲基哌啶或其组合。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述有机碱包括三乙胺。19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述式（III)的化合物、所述N，N' -二琥珀酰 亚胺基碳酸酯和所述三乙胺按约1:2:3的比例存在。20. 根据权利要求2、7、13、14和17-19中任一项所述的方法，其中所述反应在约2°C至 约30°C温度下进行。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述反应在约15°C至约25°C温度下进行。22. 根据权利要求2、7、13、14和17-21中任一项所述的方法，其中所述反应在约4°C温 度下进行。23. 根据权利要求21所述的方法，其中所述反应在约20°C温度下进行。24. 根据权利要求2、7、13、14和17-23中任一项所述的方法，其中使所述反应进行约3 至约6小时。25. 根据权利要求2、7、13、14和17-24中任一项所述的方法，其中所述反应在极性非质 子溶剂中进行。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述极性非质子溶剂包含乙腈（ACN)、四氢呋喃 (THF)、乙酸乙酯（EtOAc)、丙酮、二甲基甲酰胺（DMF)、二甲亚砜（DMSO)或其组合。27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述极性非质子溶剂包含乙腈。28. 根据权利要求3、7、13和14中任一项所述的方法，其中所述式（IV)的化合物、N-羟 基琥珀酰亚胺和N，N' -二环己基碳二亚胺按约1 : 1. 1 : 1. 1的摩尔比存在。29. 根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中m为0。30. 根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中m为1。31. 根据权利要求3、7、13、14和28-30中任一项所述的方法，其中所述反应在约2°C至 约30°C温度下进行。32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述反应在约15°C至约25°C温度下进行。33. 根据权利要求31所述的方法，其中所述反应在约4°C温度下进行。34. 根据权利要求31所述的方法，其中所述反应在约20°C温度下进行。35. 根据权利要求3、7、13、14和28-34中任一项所述的方法，其中使所述反应进行约6 至约24小时。36. 根据权利要求3、7、13、14和28-35中任一项所述的方法，其中所述反应在约7. 2至 约7. 6的pH下进行。37. 根据权利要求3、7、13、14和28-36中任一项所述的方法，其中所述反应在约7. 4的 pH下进行。38. 根据权利要求4、7、13、14、29和30中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质 的N端氨基经硝酰化。39. 根据权利要求4、7、13、14、29和30中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中赖氨酸残基 的至少一个E(e)-氨基经硝酰化。40. 根据权利要求4、7、13、14、29、30、38和39所述的硝酰化蛋白质，其中p为约1至约 25〇41. 根据权利要求4、7、13、14、29、30、38和39所述的硝酰化蛋白质，其中？为至少约 2〇42. 根据权利要求41所述的硝酰化蛋白质，其中p为至少约10。43. 根据权利要求40所述的硝酰化蛋白质，其中p为约15至约20。44. 根据权利要求4、7、13、14、29、30和38-43中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述 蛋白质包含血红蛋白（Hb)a-亚基、血红蛋白亚基、血红蛋白四聚体、肌红蛋白或白蛋 白。45. 根据权利要求44所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质包含血清白蛋白。46. 根据权利要求45所述的硝酰化蛋白质，其中所述血清白蛋白包括人血清白蛋白 (HSA)。47. 根据权利要求44所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质包含血红蛋白a-亚基或 血红蛋白亚基或血红蛋白四聚体。48. 根据权利要求44所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质包含人血红蛋白a-亚基、 人血红蛋白亚基或包含人血红蛋白a-亚基和亚基的血红蛋白四聚体。49. 根据权利要求44、47或48中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述血红蛋白四聚 体包含交联aa二聚体或交联卩卩二聚体。50. 根据权利要求49所述的硝酰化蛋白质，其中所述硝酰化蛋白质包含人血红蛋白 a-亚基。51. 根据权利要求50所述的硝酰化蛋白质，其中所述人血红蛋白a-亚基在N端缬氨 酸残基的a-氨基处经硝酰化。52. 根据权利要求50或51所述的硝酰化蛋白质，其中所述人血红蛋白a-亚基在选自 由赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨 酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨酸-139及其组合组成的组的赖氨酸残基的e-氨基 处经硝酰化。53. 根据权利要求50所述的硝酰化蛋白质，其中所述硝酰化蛋白质包含人血红蛋白 亚基。54. 根据权利要求53所述的硝酰化蛋白质，其中所述人血红蛋白亚基在N端缬氨 酸残基的a-氨基处经硝酰化。55. 根据权利要求53或54所述的硝酰化蛋白质，其中所述人血红蛋白亚基在选自 由赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖氨酸-61、赖氨酸-65、赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨 酸-95、赖氨酸-120、赖氨酸-132、赖氨酸-144及其组合组成的组的赖氨酸残基的e-氨基 处经硝酰化。56. 根据权利要求44-55中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质包含血红蛋 白四聚体并且所述血红蛋白四聚体包含约17个硝酰化氨基。57. 根据权利要求4、7、13、14、29、30和38-56中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述 硝酰化蛋白质与聚环氧烷（PAO)偶联。58. 根据权利要求57所述的硝酰化蛋白质，其中所述PAO为聚乙二醇（PEG)。59. 根据权利要求58所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG的平均分子量为约2, 000至 约20, 000道尔顿。60. 根据权利要求58所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG的平均分子量为约3, 000至 约10, 000道尔顿。61. 根据权利要求58所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG的平均分子量为约4, 000至 约6, 000道尔顿。62. 根据权利要求61所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG的平均分子量为约5, 000道 尔顿。63. 根据权利要求58-62中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG为马来酰亚 胺-PEG。64. 根据权利要求63所述的硝酰化蛋白质，其中所述马来酰亚胺经由亚烃基或亚苯基 接头与所述PEG连接。65. 根据权利要求64所述的硝酰化蛋白质，其中所述亚烃基接头为乙烯接头。66. 根据权利要求63-65中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述马来酰亚胺-PEG与 选自由以下组成的组的蛋白质的硫醇部分偶联：所述蛋白质的半胱氨酸残基的固有硫醇部 分、所述蛋白质的硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分及其组合。67. 根据权利要求66所述的硝酰化蛋白质，其中与半胱氨酸残基的固有硫醇部分偶联 或与硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分偶联的所述马来酰亚胺-PEG具有结构（VIII)其中 Z表示所述蛋白质， S为所述蛋白质的硫醇，r3为亚烃基或亚苯基， X为端基， m为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，并且n表示平均分子量为约2, 000至约20, 000道尔顿的PEG的氧乙烯单元的平均数。68. 根据权利要求67所述的硝酰化蛋白质，其中R3为乙烯。69. 根据权利要求67或68所述的硝酰化蛋白质，其中m为约6至约10。70. 根据权利要求67-69中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中X为甲氧基（_OCH3)或羧 酸酯（-COOH)。71. 根据权利要求63-70中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述马来酰亚胺-PEG与 血红蛋白0 -亚基的半胱氨酸-93残基的硫醇部分偶联。72. 根据权利要求63-71中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述马来酰亚胺-PEG与 血红蛋白a-亚基或亚基的硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分偶联。73. 根据权利要求72所述的硝酰化蛋白质，其中所述硫醇化赖氨酸残基为人血红蛋白 a-亚基的硫醇化赖氨酸残基，选自由以下组成的组：赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖 氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨 酸-139及其组合。74. 根据权利要求72所述的硝酰化蛋白质，其中所述硫醇化赖氨酸残基为人血红蛋白 亚基的硫醇化赖氨酸残基，选自由以下组成的组：赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖 氨酸-61、赖氨酸-65、赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨酸-95、赖氨酸-120、赖氨酸-132、赖氨 酸-144及其组合。75. 根据权利要求58-62中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG为琥珀酰亚胺戊 酸酯PEG(SVA-PEG)。76. 根据权利要求75所述的硝酰化蛋白质，其中所述SVA-PEG与选自所述蛋白质赖氨 酸残基的e-氨基部分、所述蛋白质末端缬氨酸残基的a-氨基部分或其组合的所述蛋白 质氨基部分偶联。77. 根据权利要求76所述的硝酰化蛋白质，其中与所述蛋白质赖氨酸残基的e-氨基 部分或所述蛋白质末端缬氨酸残基的a-氨基部分偶联的所述SVA-PEG具有结构（IX)其中： Z为所述蛋白质， N为所述蛋白质的氣基， X为端基， m为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的数量，并且 n为平均分子量为约2, 000至约20, 000道尔顿的PEG的氧乙烯单元的平均数。78. 根据权利要求77所述的硝酰化蛋白质，其中X为甲氧基（_OCH3)或羧酸酯 (-COOH)。79. 根据权利要求77或78所述的硝酰化蛋白质，其中m为平均每个四聚体约6至约 10个PAO分子。80. 根据权利要求75-79中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述SVA-PEG与血红蛋白 a-亚基或0-亚基的赖氨酸残基的e-氨基部分偶联。81. 根据权利要求75-80中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述SVA-PEG与血红蛋白 a-亚基或0-亚基的末端缬氨酸残基的a-氨基部分偶联。82. 根据权利要求80或81所述的硝酰化蛋白质，其中所述赖氨酸残基为人血红蛋 白a-亚基的赖氨酸残基，选自由以下组成的组：赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖 氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨 酸-139及其组合。83. 根据权利要求80或81所述的硝酰化蛋白质，其中所述赖氨酸残基为人血红蛋 白@ -亚基的赖氨酸残基，选自由以下组成的组：赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖氨 酸-61、赖氨酸-65、赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨酸-95、赖氨酸-120、赖氨酸-132、赖氨 酸-144及其组合。84. -种血红蛋白四聚体，其包含根据权利要求44、47、48、50-52、57-70、72、73和 75-82中任一项所述的至少一个a-亚基或根据权利要求44、47、48、53-55、57-72、74-81和 83中任一项所述的至少一个0 -亚基。85. 根据权利要求84所述的血红蛋白四聚体，其包含根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·D·范德格里夫，A·马拉瓦尔立，G·姆克尔特扬，
申请(专利权)人：桑加特公司，
类型：发明
国别省市：美国;US