本发明专利技术涉及在癌细胞中具有溶瘤作用的重组腺病毒。通过调节由E1B基因表达的E1B基因产物的剪接同工型的水平和类型，可增强此类病毒的溶瘤活性。本发明专利技术提供重组腺病毒，其中E1B-156R同工型的比例相对于野生型水平有所增加。此类重组腺病毒可以在癌细胞中选择性复制，从而杀死癌细胞同时避免杀死正常细胞。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及溶瘤腺病毒及其在治疗肿瘤性疾病中的用途。更特别地，本专利技术涉及 E1B基因的突变，所述突变调节该基因的剪接同工型的水平，从而改善溶瘤腺病毒的治疗指 数。 专利技术背景 溶瘤病毒 溶瘤病毒疗法为用于癌症治疗的新兴的治疗平台。溶瘤病毒为在具有特异性致癌 表型的癌细胞中选择性复制，从而杀死癌细胞同时避免杀死正常细胞的病毒。初步研宄集 中于天然存在的非致病性病毒，然而，这些研宄成果有限。虽然观察到肿瘤生长减缓并且正 常组织未受损，但病程未发生改变。 因此，最近的研宄已经集中于选择性地靶向癌细胞的工程重组病毒。该类工程病 毒的一个实例为在病毒基因组的E1B区突变的腺病毒。腺病毒的E1B和d53 哺乳动物肿瘤抑制蛋白p53的一种功能为介导响应于DNA损伤或外源DNA合成的 细胞周期停滞和/或细胞凋亡。因此，一些病毒，诸如腺病毒，编码在受感染细胞中使P53 失活的蛋白质以允许高效的病毒复制。这些蛋白质中的一种蛋白质，来自腺病毒的E1B区 的55千道尔顿蛋白质（E1B-55K或E1B-496R)，结合于p53,因此引起p53的大量丧失。这 从而防止P53-介导的受感染细胞的细胞凋亡。因此，E1B-496R对于在含有功能性p53的 细胞中的腺病毒的复制而言是必需的。 人肿瘤细胞对于突变的（如置换、删除、移码突变）p53等位基因经常为纯合或 杂合的，并缺乏对于正常控制细胞周期必需的p53功能（Hollstein等人（1991)Science 253:49;Levine等人（1991)Nature;351 (6326) :453-6)。因此，许多瘤细胞为p53H，因为 它们缺乏足够水平的P53和/或因为它们表达突变形式的p53,所述突变形式不能够发挥基 本的P53功能。E1B突变的腺病毒 利用瘤细胞与正常细胞之间的P53功能性差异已经对溶瘤腺病毒进行工程改造。 通过使E1B-496R蛋白质突变以除去与p53的结合相互作用或通过在E1B基因座内做出各 种删除（参见，例如US5, 677, 178)，所得腺病毒可复制并最终裂解基本上缺乏p53功能的癌 细胞，但在具有正常P53功能的细胞中并不发生裂解。 一个实例为0NYX-015 (最初命名为dl1520并且也称为H101)，一种不表达 E1B-496R蛋白质的突变腺病毒（Heise等人（1997)Nat.Med. 3(6):639-645)。病毒在翻译 起始密码子之后立即含有终止密码子并且也具有大量缺失的E1B-496R编码序列。结果该 病毒缺乏结合P53并使p53失活的能力，因此仅可在p53功能缺陷的细胞（诸如瘤细胞和 肿瘤）中高效地复制。不幸的是，E1B-496R发挥除了结合p53并使p53失活以外的其它功 能（Eager等人（2001)CancerGeneTher. 18 (5): 305-317)。因此，0NYX-015 病毒在病毒晚 期mRNA的细胞质积聚、宿主细胞关闭以及晚期mRNA的翻译中存在缺陷。因此，ONYX-015中 的突变降低突变病毒在肿瘤细胞中自身繁殖的能力。另外的问题为大量缺失使病毒基因组 不稳定。 另外的实例为0NYX-051和0NYX-053,它们为在E1B-496R蛋白质中含有点突变 (分别为R240A和H260A)而防止结合于p53的突变腺病毒。这些突变使病毒能够在p53功能 有缺陷的细胞中选择性复制，而不会降低病毒在这些细胞中复制的能力（Shen等人（2001) J.Virol. 75 (9) : 4297-4307 和US7, 785, 887)。 然而，仍迫切需要改进的突变病毒，其溶瘤能力已经得到增强并且可用于癌症的 治疗。 专利技术的公开内容 本专利技术人已经发现通过调节E1B基因表达的E1B基因产物的剪接同工型的水平和 类型，此类病毒的溶瘤活性可得到增强。因此，本专利技术的第一方面提供了重组腺病毒，在所 述重组腺病毒中E1B-156R同工型的比例相对于野生型水平有所增加，其中腺病毒在癌细 胞中具有溶瘤作用。重组腺病毒可以携带突变，如此E1B-156R同工型的比例相对于野生型 水平有所增加，使得腺病毒在癌细胞中具有溶瘤作用。突变可以在腺病毒的E1B基因的序 列中。因此，根据本专利技术的病毒在非瘤细胞中为复制受抑制的，但能够在瘤细胞（包括基本 上缺乏功能性P53的瘤细胞）中表达复制表型。 在本文描述的腺病毒的特异性实例中，E1B-156R的过表达被认为是由在腺病毒的 E1B基因中突变的93R剪接位点引起的失衡。156R能够补足某些496R功能，但并非对肿瘤 选择性（oncoselectivity)必需的功能。与现有技术相似类型的病毒相比，根据本专利技术的 病毒包括较好的体内功效的功能性E3B区。例如，Onyx-015缺乏E3B。事实上，Onyx-015病毒 及其选择性在所有方面远不如根据本专利技术的病毒。此外，专利技术人已经在正常细胞中测试根 据本专利技术制备的病毒，结果显示病毒具有显著的安全概况，特别是与已知的病毒Onyx-015 相比较。 本文中，术语"复制受抑制的病毒"或"复制缺陷的"是指在转化成癌症状态或瘤状 态的预定的细胞群中优先地抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的病毒。此类病毒在特征为非复 制的、非转化的细胞的包含正常的P53功能水平的细胞中基本上不能抑制细胞增殖、诱导 细胞凋亡或表达复制表型。此类转化细胞可以基本上缺乏P53功能，所述缺乏支持病毒复 制表型的表达。然而，根据本专利技术的病毒对瘤组织的选择性可能比仅为P53状态更广泛；像 这样的转化状态可能为选择的基础。例如，已经表明用0NYX-015病毒观察到的溶瘤选择性 可能是由于一些癌细胞系支持晚期病毒RNA从细胞核输出的能力（在正常细胞中0NYX-015 由于E1B-496R缺失而丧失的功能）。相似的机制可以在本专利技术的重组腺病毒中操作，所述 重组腺病毒具有降低水平的E1B-496R蛋白质。本专利技术的重组腺病毒中E1B-156R水平的增 加如何导致溶瘤选择性还未完全清楚。 通常，根据本专利技术的复制受抑制的病毒在包含正常的p53功能的细胞上的噬斑 效率显示出显著减少（针对合适的测定，参见Wang，Y.，G.Hallden等人（2003).〃E3gene manipulationsaffectoncolyticadenovirusactivityinimmunocompetenttumor models."Naturebiotechnology21 (11): 1328-1335) ^ 可以使用的合适测定的另一实例为 使用例如四唑鑰染料诸如MTT、XTT、MTS或WST进行细胞毒性测定以测量活细胞的丧失（参 见Berridge等人，Biotechnology Annual Review, 11:127-152 (2005)。 如本文所用，术语"复制表型"是指被病毒诸如复制受抑制的腺病毒感染的细胞的 以下表型特征中的一种或多种：（1)晚期基因产物，诸如衣壳蛋白（如，腺病毒的五邻体基 质多肽）或由病毒晚期基因启动子起始的RNA转录物的显著表达；（2)病毒基因组的复制 或复制中间体的形成；（3)病毒衣壳或包装的病毒体颗粒的装配；(4)在受感染细胞中细胞 病变效应（CPE)的出现；（5)病毒裂本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组腺病毒，其中E1B‑156R同工型的比例相对于野生型水平有所增加，其中所述腺病毒在癌细胞中具有溶瘤作用。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：汉斯·丹尼尔·奥伯格，
申请(专利权)人：艾克瑟根有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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