使用抗衰老化合物生产蛋白质的方法技术

提供了在包含抗衰老化合物例如抗氧化剂肌肽的细胞培养物中生产蛋白质的方法。根据本发明专利技术的教导，在包含抗衰老化合物的细胞培养基中生长的细胞呈现增加的生存力和产量。此外，在存在抗衰老化合物时生长的细胞培养物在细胞培养基中呈现降低水平的高分子量聚集体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交互参考本申请与于2005年10月24日提交的美国临时专利申请号60/729，573共同待决、与其共有至少一个共同专利技术人、并且要求其优先权，其中所述的美国临时专利申请号 60/729，573以其全部内容引入本文作为参考。专利技术背景本公开总体上涉及在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白质。本公开尤其涉及在存在抗衰老化合物例如肌肽下培养哺乳动物细胞、从而高质量地维持生存力并增加产量。培养细胞已经生产了许多蛋白质产物。这些产物例如杂交瘤生产的单克隆抗体可以用于治疗、 研究或其它用途。动物细胞、尤其是哺乳动物细胞通常用来生产蛋白质。遗憾的是，使用动物细胞使得生产过程既耗时又昂贵。向细胞培养基中添加化学试剂可通过诱导细胞产生产物来增加细胞产量，从而增加总收率。使用的最适试剂依赖于许多因素而不同，其中包括期望的蛋白质产物和细胞类型。类似因素也影响所选试剂的添加量、以及向细胞培养基中加入试剂的时间。试剂的实例为链烷酸或盐、尿素衍生物或二甲基亚砜(DMSO)。化学试剂例如丁酸钠对蛋白质生产具有不同的影响。虽然添加试剂可增加细胞的比产量，但也具有细胞毒作用、并且会抑制细胞的生长和生存力。因为细胞产生蛋白质，所以一般而言，蛋白分泌入细胞培养基。然而，特定蛋白质并非培养基中唯一的物质；培养基中经常存在高分子量聚集体、酸性物质(acidic species)和其它物质，这使得纯化过程更加费力和昂贵。存在改善产物质量、使得蛋白质纯化更加有效的技术和方法，其中所述技术和方法包括改变生物反应器条件或使用不同细胞系的技术和方法。然而，在本领域中仍然存在对改善纯化过程的蛋白质生产技术和方法的需求。因此，需要的是，加入细胞培养基中可在维持高细胞生存力的同时增强目的蛋白质表达的化学试剂。进一步需要的是通过降低细胞培养中高分子量聚集体和酸性物质的量来增加蛋白质产物质量的试剂。专利技术概述在某些实施方案中，本公开涉及提高蛋白质产物生产的方法。例如，在某些实施方案中，本专利技术提供在包含抗衰老化合物的培养基中培养表达目的蛋白质的宿主细胞、从而总体的目的蛋白质生产提高的方法。在某些实施方案中，该抗衰老化合物包含肌肽。在某些实施方案中，本专利技术提供增强目的蛋白质生产的组合物。例如，在某些实施方案中，本专利技术提供包含增强在宿主细胞中表达的目的蛋白质生产的抗衰老化合物的细胞培养基。在某些实施方案中，该抗衰老化合物包含肌肽。在某些实施方案中，联合经遗传操作的宿主细胞和种子培养基(inoculum medium)来形成细胞培养基,其中所述细胞培养基在生物反应器中生长。在预期蛋 白质产物的生产进程中，可以改变生物反应器的条件和/ 或添加补充物来增加产量和/或维持生存力。补充物可以包括补料培养基(feed medium) 和/或一种或多种添加物例如本公开中的肌肽和/或其它抗衰老化合物。在生物反应器中，哺乳动物宿主细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在临近生产进程结束时会遭受生存力的降低。已经发现，向细胞培养基中加入抗衰老剂例如肌肽及其类似物有助于维持更高的活细胞数目和细胞生存力直到收获蛋白质。此外，可以根据本专利技术使用增加产量的方法，例如在生产进程的生长期后和/或在生产期改变温度。仅举一例，在蛋白质产物尤其是生长分化因子-8(GDF-8)的抗体的生产期间，将温度下调来帮助起始并增加产量。在某些实施方案中，加入抗衰老化合物例如肌肽有助于增加细胞培养物的产量。在某些实施方案中，可以在此种温度变动之前、期间和/ 或之后加入抗衰老化合物。也已发现，向细胞培养基中添加抗衰老化合物例如肌肽提高了蛋白质产物的整体质量。在蛋白质生产期间，高分子量的聚集体以及其它不需要的物质都存在于细胞培养基中。加入肌肽降低高分子量聚集体的量、并提高产物质量。在某些实施方案中，加入除肌肽之外的抗衰老化合物降低此类高分子量聚集体的积聚、并改善产物质量。在某些实施方案中，肌肽与一种或多种额外的抗衰老化合物联合加入。向细胞培养基中添加的抗衰老化合物(例如肌肽)的浓度根据方法的许多因素而不同，其中所述因素包括例如细胞类型、期望的产物、以及生物反应器的条件等等。此外，肌肽也可用其类似物乙酰肌肽、高肌肽(homo-carnosine)、鹅肌肽和β -丙氨酸替换。在某`些实施方案中，肌肽与一种或多种其它抗衰老化合物联合提供。在某些实施方案中，细胞培养基中抗衰老剂的浓度(例如肌肽)为大约5mM到大约lOOmM。在某些实施方案中，浓度为大约IOmM到大约40mM。在某些实施方案中，浓度为大约20mM。任何适当的培养方法和种子培养基都可以在蛋白质生产的方法中使用。血清和无血清培养基均可使用。此外，可使用适合特定细胞类型和蛋白质产物的培养方法来培养细胞。此类方法为细胞培养领域的普通技术人员所熟知和理解。本公开的其它特征和优点在下列描述和权利要求中显而易见。附图简述图1a肌肽对MY0-29酸性峰(acidic peak)的影响。图1b肌肽对高分子量聚集体的影响。图1c在不同天添加肌肽对酸性峰的影响。图1d在不同天添加肌肽对高分子量聚集体的影响。图2a肌肽对日活细胞密度的影响。图2b肌肽对日细胞生存力的影响。图2c肌肽对日滴度的影响。图2d肌肽对累积的比细胞产量的影响。图2e肌肽对于高分子量聚集体的影响。图3a不同浓度肌肽对活细胞密度的影响。图3b不同浓度肌肽对日细胞生存力的影响图3c不同浓度肌肽对日滴度的影响。图3d不同浓度肌肽对累积的比细胞产量的影响。图3e不同浓度肌肽对高分子量聚集体的影响。定义遵循长期约定，当在本申请、包括权利要求中使用术语“一”和“一个”时，其表示 “一个或多个”。即使本专利技术已描述为具有某定程度的特异性，也明确的是，根据本专利技术的许多备选、修改和变更对本领域技术人员是显而易见的。因此，可以预期，所有符合本专利技术主旨和范围的此类备选、修改和变更都包含在定义的权利要求书内。本文所用术语“抗衰老化合物”指的是任何加入细胞培养物中时促进其中生长的细胞的生存力、生长、和/或寿命的试剂或化合物。在某些实施方案中，在细胞培养中使用此类抗衰老化合物与其它培养条件相同但缺乏抗衰老化合物的培养条件相比，导致滴度增力口、细胞比产量(cell specificproductivity)增加、细胞生存力增加、综合的活细胞密度增加、高分子量聚集体积聚减少和/或酸性物质积聚减少。根据本专利技术的方法和组合物可以使用的抗衰老化合物的非限制性实例包括肌肽、乙酰肌肽、高肌肽、鹅肌肽和β -丙氨酸。在某些实施方案中，根据本专利技术的方法和组合物可以使用两种或多种抗衰老化合物。短语“宿主细胞”指的是能够遗传操作和/或能在细胞培养基中生长和存活的细胞。一般地，细胞能表达大量内源或异源的目的蛋白质、并且能保留蛋白质或将其分泌到细胞培养基中。宿主细胞一般为“哺乳动物细胞”，其包含非限制性实例的脊椎动物细胞，其中包括幼仓鼠肾细胞(BHK)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肾脏细胞(293)、正常胎猕猴二倍体 (normal fetal rhesus diploid) (FRhL-2)和鼠骨髓瘤(例如 SP2/0 和 NSO)细胞。本领域普通技术人员知道可以根据本专利技术方法和组合物使用的其它宿主细胞。术语“细胞培养基”指的是含有支持细胞在可生长、并生产预期蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
在细胞培养物中生产蛋白质的方法，其包括步骤：　　　　在包含抗衰老化合物的细胞培养基中培养含有编码目的蛋白质的基因的哺乳动物细胞，其中所述基因在细胞培养条件下表达；和　　　　在条件下维持培养并维持足以允许蛋白质表达的时间；　　　　其中所述的细胞培养物呈现改善的细胞培养特性，所述细胞培养特性不同于缺少抗衰老化合物但其它方面相同的条件下在其它方面相同的培养基中观察到的相应的细胞培养特性；　　　　其中所述的改善的培养特性选自增加的滴度、增加的细胞比产量、增加的细胞生存力、增加的综合的活细胞密度、减少的高分子量聚集体累积、减少的酸性物质累积及其组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：YT栾，W王，P索迪，D德拉波，J周，
申请(专利权)人：惠氏公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]