以蛋白质分泌功能为靶的抗耐药性化合物筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种以蛋白质分泌功能为靶的抗耐药性化合物筛选方法。针对目前临床上急需克服各种耐药菌的药物，本发明专利技术采用产生抗生素分解或钝化酶的耐药菌作指示菌，首先在含指示菌和对该指示菌临界生长浓度抗生素的琼脂培养基平板上筛选出蛋白质分泌减量剂和抗生素分解或钝化酶抑制剂；然后在含有抗生素、抗生素分解或钝化酶和对抗生素敏感的同种指示菌琼脂培养基平板上检测出抗生素分解或钝化酶的抑制剂，从而获得蛋白质分泌减量剂。蛋白质分泌减量剂可同多种抗生素混合用于杀灭多种抗生素耐药菌。本发明专利技术可用于从化学合成物库、天然产物库（微生物发酵物、中草药和海洋生物提取物）中筛选蛋白质分泌减量剂，具有操作简便、样品用量小和筛选通量高等优点。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗耐药性化合物的筛选方法。
技术介绍
30年代和40年代末期，磺胺类药物和青霉素类药物分别开始用来杀灭病源细菌，虽然同抗生素问世以前相比，细菌性疾病的发病率和死亡率已经大幅度下降，但由于大量使用抗生素造成的强大选择性压力以及迅速的适应和进化使得抗药性机制在普通病源菌中广泛传播。即使在发达的美国，每年仍有成千上万的人死于该病，在发展中国家情况更为严重。对有些耐药性细菌，只有很少种类的药物，甚至根本就没有药物供医生选择。目前广泛用于临床的抗生素是以不同的细胞学过程为攻击靶点的。氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类抗生素抑制蛋白质的合成，β-内酰胺类、糖肽类抗生素抑制细胞壁的合成，喹诺酮类抑制DNA超螺旋化，磺胺类药物抑制叶酸的合成。细菌细胞中的抗生素作用靶点应具备的条件是关系着细菌细胞的生死存亡，在细菌细胞内分布广泛且高度保守而在人体细胞中不存在。换言之，只有那些与致病行为相关的功能才适合作为理想的新抗生素的作用靶点。CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY2000年载文中详细阐明了横跨细胞膜的蛋白质的分泌过程将是最具潜力的新抗的作用靶点，蛋白质的分泌功能可使一些用于构建细胞外膜，菌毛或鞭毛的蛋白质以及毒素、酶蛋白等分泌到细胞外。细菌蛋白质分泌功能减弱或受阻，势必会造成其生长受到抑制，失去毒力以及其破坏抗生素的酶蛋白分泌减弱或受阻失去耐药性。需要指出，在各种耐药性生物化学机理中，“耐药菌产生分解或钝化抗生素的酶”机理是最清楚、最普遍的。作为一种抗耐药性化合物，蛋白质分泌减量剂可同相应抗生素混合用于杀灭那些因产生并分泌出分解钝化抗生素的酶蛋白而产生耐药性的病源菌。但至今尚无公开发表的具体筛选方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种。为达到以上目的，本专利技术采用产生抗生素分解或钝化酶的耐药菌作指示菌，首先在含指示菌和对该指示菌临界生长浓度抗生素的琼脂培养基平板上筛选出蛋白质分泌减量剂和抗生素分解或钝化酶抑制剂；然后在含有抗生素、抗生素分解或钝化酶和对抗生素敏感的同种指示菌琼脂培养基平板上检测出抗生素分解或钝化酶的抑制剂，从而获得蛋白质分泌减量剂。具体步骤如下(一)、初筛1、选择合适的初筛指示菌及其培养基指示菌选择的标准是该菌能产生并分泌抗生素分解或钝化酶的菌株，由于目前急需对付革兰氏阳性病源菌的药物，所以用革兰氏阳性菌作指示菌来建立的筛选方法会是很有用的，所用的菌株必须是背景清楚，操作方便。并选择适合该种指示菌生长的培养基。2、测定抗生素对指示菌的临界生长浓度，即在此抗生素浓度下指示菌刚好能生长，高于此抗生素浓度指示菌生长受到抑制。3、筛选平板与对照平板将选定的指示菌和足够的但需在其临界生长浓度以下的抗生素与琼脂培养基混合后，制成筛选平板；对照平板中不含抗生素。4、筛选同时用无菌滤纸圈浸取液体样品或用无菌牙签直接挑取少量固体样品置于筛选平板和对照平板，每一平板上可放置多个样品，在一定温度下培养一定时间后，观察平板上生长抑制圈的出现。5、筛选结果的判断和处理凡在筛选平板上出现生长抑制透明圈而在对照平板上不出现生长抑制透明圈的样品被认为含蛋白质分泌减量剂或抗生素分解或钝化酶抑制剂进入复筛。(二)、复筛1、选择合适的复筛指示菌及其培养基复筛指示菌选择的标准必须是与初筛指示菌同种并且是抗生素敏感菌。培养基同初筛指示菌培养基。2、复筛平板与对照平板的制备将复筛指示菌、适量抗生素、适量抗生素分解或钝化酶与琼脂培养基混合后，制成复选平板。对照平板中不加抗生素。3、复筛试验同时用无菌滤纸圈浸取液体样品或用无菌牙签直接挑取少量固体样品置于复筛平板和对照平板，每一平板上可放置多个样品，在一定温度下培养一定时间后，观察平板上生长抑制圈的出现。4、筛选结果的判断和处理凡在复筛平板上出现生长抑制透明圈而在对照平板上不出现生长抑制透明圈的样品被认为含抗生素分解或钝化酶抑制剂；在复筛平板和对照平板上都不出现生长抑制透明圈的样品被认为含蛋白质分泌减量剂。本专利技术的优点在于1、可广泛用于从微生物发酵液、中草药和海洋生物萃取物以及化学合成物中筛选抗耐药性化合物；2、筛选出的蛋白质分泌减量剂是一种以蛋白质分泌功能为靶的抗耐药性化合物，可同多种抗生素混合广泛用于杀灭多种因产生并分泌分解钝化抗生素的酶蛋白而引起耐药性的病源菌，对开发克服微生物耐药性的药物具有重大意义；3、操作方便快捷，可同时处理多个样品，进行大样本量筛选；4、本方法设计严密、合理、结果可靠。具体实施例方式初筛材料和方法指示菌Bacillus cereus CCRC11267.β-内酰胺酶产生菌。斜面菌种培养基组成Peptone 5g，Beef extract 3g，NaCl 5g，MnSO4·H2O5mg，Agar 15～20g，DH2O 1000ml，pH7.0～7.2. 115℃30分钟杀灭。筛选培养基组成同斜面菌种培养基，装量100ml/250ml三角瓶，115℃，30分杀灭。茄子瓶培养基组成酪蛋白水解物10g，酵母膏3g，牛肉膏1.5g，葡萄糖1g，琼脂15～20g，DH2O 1000ml，pH7.0～7.2，115℃，30分杀灭。指示菌悬液的制备在茄子瓶中装60ml茄子瓶培养基，115℃，30分钟杀灭，摆成斜面，凉至室温后接种CCRC11267斜面菌种。30℃培养7天至孢子完全成形。用30ml无菌生理盐水洗下细胞，置65℃水浴30分钟杀死营养细胞。用无菌生理盐水离心洗涤细胞三次。将全部细胞用30ml无菌生理盐水悬浮，再次65℃水浴30分钟杀死营养细胞。1ml/1.5ml离心管分装并置4℃冰箱保藏备用。筛选平板(Test plate)的制备向48℃水浴中盛有100ml筛选培养基的250ml三角瓶中加入稀释10倍的CCRC11267指示菌悬液0.5ml，摇匀，再加入0.5--1.0ml青霉素钠母液(10mg/ml)，摇匀，使成50--100μg青霉素钠/ml培养基。用开口吸管制备15ml培养基/9cm培养皿筛选平板。对照平板的制备与筛选平板相同，只是培养基中不含青霉素。筛选方法对于液体样品，如微生物发酵液，中草药抽提物等，用无菌五层直径6mm新华一号滤纸片蘸取样品置筛选平板(Test Plate)和对照平板(Control plate)；对于固体样品，则用无菌牙签粘少许置筛选平板(Test Plate)和对照平板(Control plate)。每个平板放置16个样品和1个在浓度为10μg～50μg/ml的青霉素酶抑制剂棒酸或舒巴坦溶液中浸过的滤纸片代作阳性对照物。置30℃培养12--20小时，观察平板上生长抑制圈的出现。筛选结果的判断和处理凡在筛选平板(Test plate)上引起生长抑制(出现生长抑制透明圈)而在对照平板(Control plate)上不引起生长抑制(不出现生长抑制透明圈)的样品被认为含蛋白质分泌减量剂或β--内酰胺酶抑制剂移交复筛程序。复筛材料和方法青霉素酶溶液的制备按进行，其活力测定按进行，并换算成Levy单位表示。指示菌Bacillus cereus AS1.1686。青霉素超敏感菌株。斜面菌种培养基组成、茄子瓶培养基组成和指示菌悬液的制备同初筛。复筛培养基组成同初筛。100ml培养基/250ml三角瓶。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以蛋白质分泌功能为靶的抗耐药性化合物筛选方法，其特征是：采用产生抗生素分解或钝化酶的耐药菌作指示菌，首先在含指示菌和对该指示菌临界生长浓度抗生素的琼脂培养基平板上筛选出蛋白质分泌减量剂和抗生素分解或钝化酶抑制剂；然后在含有抗生素、抗生素分解或钝化酶和对抗生素敏感的同种指示菌琼脂培养基平板上检测出抗生素分解或钝化酶的抑制剂，从而获得蛋白质分泌减量剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：官家发，范成英，廖连华，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]