用于将化合物导入神经细胞的转运蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种转运蛋白，其可以通过修饰肉毒杆菌形成的神经毒素重链而得到。该蛋白以比天然神经毒素更高的亲合力专一性地结合于神经细胞。本发明专利技术还涉及一种转运蛋白的生产方法、编码转运蛋白的核酸、含有药物的转运蛋白和美容组合物及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种结合于神经元的转运蛋白，其由受体介导的胞吞作用调节并且从酸性内体小室(endosomal compartment)转移进入神经元胞质液。该蛋白质被用作转运手段用于转移其它化学物质(例如蛋白酶)，该蛋白酶是不能生理学地穿过质膜渗入神经细胞胞质液。本专利技术涉及转运蛋白用于抑制神经递质释放的用途。
技术介绍
神经细胞通过胞吐作用释放递质。胞内泡囊的膜与质膜的融合称为胞吐作用。在这一加工过程中，将泡囊的内容物同时地排至突触间隙。两种膜的融合由钙调节，与蛋白质突触结合蛋白(synaptotagmin)发生反应。与其它辅助因子突触结合蛋白一起控制三个所谓的融合蛋白SNAP-25、小突触泡蛋白2和突触融合蛋白1A的状态。而突触融合蛋白1A和小突触泡蛋白2被整合进入血浆和/或泡囊膜中，SNAP-25仅松弛地结合于质膜。三种蛋白质彼此结合至胞内钙浓度增加的程度，彼此两个膜靠近，接着融合在一起。在释放胆碱能神经元乙酰胆碱情况下，会引起肌肉收缩，出汗及其它胆碱能激发反应。上述的融合蛋白是靶分子(底物)梭菌神经毒素轻链，由肉毒杆菌(Clostridium botulinum)形成。厌氧的革兰氏阳性细菌肉毒杆菌产生七种不同类型的蛋白质神经毒素。末尾的神经毒素称为肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A至BoNT/G)。其中，特别是BoNT/A和BoNT/B会引起人和动物神经性麻痹的机能障碍，称为肉毒中毒。在土壤中可以找到肉毒杆菌孢子，但在经不正确杀菌和密封的自制食品保存时也可以生长，许多肉毒中毒情况可归于此因。BoNT/A是在已知生物制剂物质中最致命的。少至5-6pg的纯化BoNT/A代表一个最低致死剂量MLD(MultipleLowDose)。每个重18-20g的雌性Swiss Webster鼠腹膜内注射后，杀死一半的一个单位(Engl.单位U)BoNT定义为MLD。七种免疫不同的BoNT得到表征。它们标示为BoNT/A、B、C1、D、E、F和G，并且可以通过与特定血清型抗体的中和而辨别。就引起的麻痹严重程度和持续时间而言，在被影响的动物种类中不同血清型的BoNT是不同的。这样，就麻痹而言，例如BoNT/A在大鼠中的效力是500倍于BoNT/B。另外，已经证明在灵长类动物中480U/kg体重的BoNT/B剂量是无毒的。相同量的BoNT/A相当于该物质在灵长类动物中致死量(LD)的12倍。另一方面，在老鼠身上注射BoNT/A后麻痹持续时间比注射BoNT/E后长十倍。BoNTs在临床上已经用于处理神经肌肉失调，通过骨骼肌机能亢进得到表征，是由病理性活动过度的周围神经引起的。BoNT/A已经被美国食品和药物管理局批准用于处理眼睑痉挛、斜视和半面痉挛。相比BoNT/A，残留的BoNT血清型明显地有效性较小，并且显示出较短的效力持续时间。周围肌肉注射给药BoNT/A的临床效果通常观察一周。通过一种单一肌肉注射BoNT/A的症状抑制持续时间通常是大约3个月。梭菌神经毒素专一性地水解不同融合组织的蛋白质。BoNT/A、C1和E裂解SNAP-25，而BoNT/B、D、G以及破伤风神经毒素(TeNT)攻击泡囊相关膜蛋白(vesicle-associatedmembrane protein，VAMP)2-也称为小突触泡蛋白2-。此外BoNT/C1也裂解突触融合蛋白1A。梭状芽孢杆菌细菌释放神经毒素，其为单链多肽，都具有1251至1315个氨基酸。其后内源蛋白酶在限定位置处将每一种这些蛋白质分解为2条链(切断)，然而两条残留的链通过二硫桥相连结。这些双链蛋白质称为赫勒毒素(holo-toxins)(参见Shone等(1985)，Eur JBiochem 151，75-82)。两条链具有不同的功能。较小的片段即轻链(轻链LC)代表Zn2+依赖性内切蛋白酶，而较大的单元(重链HC)代表轻链的转运手段。通过用内肽酶处理HC，产生两个50kDa片段(参见Gimenez等(1993)，J Protein Chem 12，351-363)。该氨基端的一半(HN片段)在低pH值下整合进入膜内，并且使得LC能够渗入神经细胞胞质液内。羧基端的一半(Hc片段)结合于复合物聚唾液酸神经节苷脂(polysialoganglioside)，该结合在神经细胞膜中排他性地发生，并且迄今为止未鉴定蛋白质受体(Halpern等(1993)，Curr Top MicrobialImmunol 195，221-241)。后者解释了梭菌神经毒素的高神经选择性(neuroselectivity)。晶态结构证实BoNT/A去掉了三个结构域，其可以通过三个步骤的作用机制进行调和(参见Lacy等(1998)，Nat Struct Biol 5，898-902)。此外，这些数据得出这样一种结论在Hc片段内部有两个自主性的亚单元(亚结构域)存在，每个25kDa。存在两个功能性亚结构域的第一个证据是由TeNT的Hc片段的氨基端(HCN)和羧基端一半(Hcc)产生的，其表达为重组体形式，并且显示Hc-，但没有HCN结构域结合于神经元(参见Herreros等(2000)，Biochem J 347，199-204)，人们在BoNT/B和G的Hcc结构域内部发现了突触结合蛋白的蛋白质受体结合部位，证明它们有单独的功能性(参见Rummel等(2004)，J Biol Chem 279，30865-70)。在生理条件下，HC结合神经元的神经节苷脂，这是通过受体介导的胞吞作用在细胞内部得到接收，并且经由内体小室(endosomal compartment)到达固有的泡囊循环(vesiclecirculation)。在早期内体(early endosomes)的酸性介质内，HN即HC的氨基端一半渗入泡囊膜并且形成小孔。每种经由二硫桥与HC连接的物质(X)将通过胞内氧化还原系统从HC分裂出来，进入二硫桥并使其还原。X最终出现在胞质液内。在梭菌神经毒素HC是LC载体情况下，在最后的步骤中于胞质液内裂解它的专一性底物。融合蛋白的复合物形成和分解周期中断，并且因此抑制了乙酰胆碱的释放。其结果是，横纹肌无力并且汗腺停止分泌。单独的BoNT血清型的活性周期各不相同，并且取决于胞质液内完整LC的存在。因为所有神经元都具有梭菌神经毒素受体，不仅乙酰胆碱的释放可能受影响，而且可能也影响P物质、去甲肾上腺素、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸、内啡肽及其它递质和激素的释放。胆碱能传递优先受到阻塞，这可以通过在外围的HC进入神经元的事实得到解释。中心突触通过不能复盖有蛋白质的血脑屏障得到保护。HC对周围神经细胞具有高的亲合力，其主要通过与复合物聚唾液酸神经节苷脂相互作用被传递，这些复合物聚唾液酸神经节苷脂是乙二醇类脂物，由一种以上唾液酸组成(参见Halpern等(1995)，Curr Top Microbiol Immunol 195，221-41)。其结果是，与它们相结合的LC仅到达该细胞类型并且仅在这些细胞中变得有活性。BoNT/A和B每个仅仅结合一分子神经节苷脂GT1b。为了研究构建结合腔的氨基酸扮演的角色，根据本专利技术制造出一个重组体Hc片段。该技术允许交换单独的氨基酸，这样，荷正电的氨基酸可以由荷负的电或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转运蛋白，其通过对肉毒杆菌形成的神经毒素重链修饰而获得，所述蛋白结合于神经细胞的亲合力比天然神经毒素结合于神经细胞的亲合力更高。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德列斯隆美尔，
申请(专利权)人：托克索基因有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]