本发明专利技术提供了单链、多肽融合蛋白，其包含：非细胞毒性蛋白酶或其片段，该蛋白酶或蛋白酶片段能切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白；寻靶部分，其能结合到靶细胞上的结合位点，该结合位点能经历内吞作用而被导入到靶细胞内的内体中；蛋白酶切割位点，在该位点上融合蛋白可被蛋白酶切割，其中蛋白酶切割位点位于非细胞毒性蛋白酶或其片段与寻靶部分之间；以及转运结构域，其能转运蛋白酶或蛋白酶片段从胞内体内部穿过胞内体膜，并进入靶细胞的胞质溶胶。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含非细胞毒性蛋白酶、寻靶部分、蛋白酶切割位点和转运结构域的融合蛋白本专利技术涉及非细胞毒性融合蛋白，及其治疗应用。毒素按它们对靶细胞影响的类型通常可被分为两类。更具体地说，第 一类毒素杀死它们自然靶细胞，因此被称为细胞毒素分子(cytotoxic toxin molecules)。这组毒素的例子是植物毒素例如蓖麻毒素、相思豆毒素，和细菌毒素 例如白喉毒素、假单细胞外毒素A等等。为了治疗细胞失调和像癌症这样的疾病， 细胞毒性已经吸引了很多人设计"魔法子弹(magic bullet)"的兴趣(例如，免疫偶 联物(immunoconjugates)，其包括细胞毒性组分和与耙细胞上特定标志物结合的 抗体)。典型地，细胞毒素通过抑制细胞的蛋白合成过程杀掉它们的靶细胞。第二类毒素，其被称为非细胞毒素(non-cytotoxic toxins)，并不杀死它 们的自然耙细胞(如它们的名字证实的)。非细胞毒素与它们的细胞毒素对等物相 比，吸引了较少的商业兴趣，非细胞毒素通过抑制蛋白合成以外的其它细胞过程 来施加它们对靶细胞的影响。非细胞毒素可被多种植物和微生物所产生，这些微 生物例如梭菌属某种(C/oy/,'/^"wsp.)和奈瑟菌属某种(M^wn'"sp.)。梭菌神经毒素(Clostridial neurotoxins)是典型地分子量在150 KDa (150,000道尔顿)级别的蛋白。它们可由多种细菌产生，特别是梭菌属 (Clostridium),其最重要的为破伤风梭菌(C. /"""/)，和肉毒梭菌(C. &0^//"娜)、 丁酸梭菌(C. 6w，/c謂)和阿根廷梭菌(C. wge;W/"m^)的多个种。目前，有八 种不同类别的梭菌神经毒素，即破伤风毒素和血清型为A、 B、 Cl、 D、 E、 F、 G的肉毒神经毒素，它们具有相似的结构和作用方式。梭菌神经毒素代表了非细胞毒素分子的一个主要类型，它们作为单链 多肽由宿主细菌所合成，该多肽通过蛋白水解切割活动被翻译后修饰进而形成被 二硫键连在一起的两条多肽链。这两条链叫做重链(H-chain)和轻链(L-chain)， 该重链的分子量大约为100KDa (100,000道尔顿)，轻链的分子量大约为50KDa (50,000道尔顿)。轻链具有蛋白酶功能(锌依赖性肽链内切酶活性)以及对与囊泡和/或 质膜相连且涉及胞吐过程的蛋白具有高度的底物特异性。源自不同梭菌种类或血 清型的轻链可水解不同的、但是特异的三种底物蛋白中的一种的肽键，这三种蛋 白即突触囊泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25。这些底物是神经分泌机制的重要 成分。奈瑟菌属某种(A^^w/o sp.)，最重要的为来自淋病奈瑟菌(W. go"wr/ "e)种类，可产生功能相似的非细胞毒性蛋白酶。这种蛋白酶的一个实 例是IgA蛋白酶(见W099/58571)。在本领域，已经充分证明了毒素分子可重新靶向(retarget)于不是毒 素自然靶细胞的细胞。当发生所谓的重新靶向吋，修饰的毒素能结合于期望的耙 细胞并随后转运进入细胞溶胶，从而能够对靶细胞施加其影响。所述的重新靶向 通过用不同的寻靶部分(Targeting Moiety (TM))代替毒素的天然寻靶部分来完成。 在这点上，选择TM以便其能与期望的靶细胞结合，并且允许修饰的毒素随后进 入革巴细胞内的内体中。修饰的毒素也包含转运结构域，以便能让非细胞毒性蛋白 酶迸入胞质溶胶。该转运结构域可以是毒素的天然转运结构域，或者它也可以是 源自于有转运活性的微生物蛋白的不同的转运结构域。例如，WO94/21300描述了修饰的梭菌神经毒素分子，该分子能调控存 在于靶细胞表面的膜内在蛋白(整合膜蛋白，Integral Membrance Protein (IMP)) 的密度。该修饰的神经毒素分子因此能控制靶细胞的细胞活性(举例来说，葡萄 糖的吸收)。W096/33273和WO99/17806描述了定位于外周感觉传入神经的修饰 的梭菌神经毒素分子。该修饰的神经毒素分子因此能表现出镇痛作用。 WO00/10598描述了定位于粘液分泌过多细胞(或者控制所述的粘液分泌过多细胞 的神经细胞)的修饰的梭菌神经毒素分子的制备，该修饰的神经毒素能抑制所述 细胞的分泌过多。WO01/21213描述了定位于多种不同类型的非神经靶细胞的修饰 的梭菌神经毒素分子。该修饰的分子因此能抑制靶细胞的分泌。在重新靶向的毒 素分子的
里，其它的公布包括WO00/62814、 WO00/04926、 US5，773,586、 W093/15766、 WO00/61192和W099/58571 。上述的TM替代作用可被传统的化学偶联技术所实现，这些技术对于 技术人员是众所周知的。在这点上，Hermanson， G.T. ( 1996 )Bioconjugate techniques ， Academic Press 禾口 Wang, S.S. (1991) ,Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press,可作为参考。然而，化学偶联(chemical conjugation)经常是不精确的。例如，在偶 联之后，TM可以在一个以上的附着点上连接到结合体的其它部分。化学偶联也难以控制。例如，TM可通过蛋白酶成分和/或转运成分上 的附着点连接到修饰的毒素的其它部分。当为了治疗功效要求仅仅附着于其中一 个所述的成分时(优选地在单一位点)，这是有问题的。因此，化学偶联导致了修饰的毒素分子的混合群体，这是不想要的结果。作为对化学偶联的替代方法，TM替代可通过单一多肽融合蛋白的重组 制备来实现(见WO98/07864)。这种技术是基于细菌体内制备天然梭菌神经毒素 (也就是全毒素)的机制，该技术导致融合蛋白具有以下结构排列氨基-闺白酶成分H转运成分HTM]-羧基依照WO98/07864, TM被置于靠近融合蛋白的C-末端的地方。然后融 合蛋白通过使用蛋白酶处理被活化，该蛋白酶的切割位点位于蛋白酶成分和转运 成分之间。双链蛋白被如此产生了，该蛋白包括蛋白酶成分，其作为单一多肽链 通过共价键(通过二硫桥)与包含转运成分和TM的另一条单一多肽链相连接。 当WO98/07864的方法遵照梭菌全毒素的自然表达的系统时(依照融合蛋白的结 构排列)，本专利技术人发现这个系统可以导致某些融合蛋白的生成，这些融合蛋白对 目的耙细胞具有基本上降低的结合能力。因此需要一个替代的或改善的系统去构建非细胞毒性的融合蛋白。本专利技术通过提供单链多肽融合蛋白，来致力于解决一个或多个上述的问 题，所述单链多肽融合蛋白包括a. 非细胞毒性蛋白酶，或其片段，该蛋白酶或蛋白酶片段能在靶细胞 里切割胞吐融合器(exocyticfosionapparatus)的蛋白；b. 寻靶蛋白，其能结合于靶细胞上的结合位点，该结合位点能经历内 吞作用以导入处于靶细胞内的内体中；c. 蛋白酶切割位点，在该位点融合蛋白可被蛋白酶切割，其中蛋白酶 切割位点位于非细胞毒性蛋白酶或其片段与寻靶部分之间；以及转运结构域，其能转运蛋白酶或蛋白酶片段从内体中穿过内体膜并进入靶细胞的 胞质溶胶中。 WO98本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单链、多肽融合蛋白，其包括： ａ．非细胞毒性蛋白酶或其片段，该蛋白酶或蛋白酶片段能切割靶细胞的胞吐融合器的蛋白； ｂ．寻靶部分，其能结合到所述靶细胞的结合位点，该结合位点能经过细胞内吞作用而被导入到所述靶细胞内的内体中； ｃ．蛋白酶切割位点，在该位点所述融合蛋白可以被蛋白酶切割，其中所述蛋白酶切割位点位于所述非细胞毒性蛋白酶或其片段与所述寻靶部分之间；以及 ｄ．转运结构域，其能转运所述蛋白酶或蛋白酶片段从内体内部穿过所述内体膜，进入所述靶细胞的胞质溶胶。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：K福斯特，J查多克，P马科斯，P斯坦孔贝，L杜勒斯，
申请(专利权)人：健康保护机构，
类型：发明
国别省市：GB[英国]
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