柱上酶切割制造技术

本文报道了一种通过固定化金属离子亲和层析从在其N-或C-末端包含金属离子亲和层析标签和蛋白酶切割位点的多肽原(pro-polypeptide)获得多肽的方法，所述方法包括通过将结合的多肽原与蛋白酶孵育从固定化金属离子亲和层析柱回收多肽的步骤，其中已经至少用尿素溶液清洗固定化金属离子亲和层析材料至少一次。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术属于使用固定化金属离子亲和层析联合通过柱上切割酶移除金属离子亲和层析标签的多肽纯化和多肽生产领域。因此，本文报道了使用蛋白酶柱上切割包含金属离子亲和层析标签的多肽的方法。专利技术背景蛋白在现今的医用组合中发挥重要的作用。用于生产重组多肽的表达系统在本领域中是公知的。用于药物应用的多肽主要在原核细胞，比如大肠杆菌中，和哺乳动物细胞比如CHO细胞，NS0细胞，Sp2/0细胞，COS细胞，HEK细胞，BHK细胞，细胞等中生产。对于人类应用，每种药用物质必须满足不同的标准。为了保证生物药剂对人的安全性，例如，会引起严重危害的核酸，病毒，和宿主细胞蛋白必须被移除。为了满足质量管理规格标准(regulatory specification)，一个或更多个纯化步骤必须遵循制造工艺。其中，纯度，通量，和产量在决定合适的纯化工艺方面发挥重要作用。不同方法已得到确认并且广泛用于蛋白纯化，比如用微生物蛋白亲和层析(例如蛋白A或蛋白G亲和层析)，离子交换层析(例如阳离子交换(磺丙基或羧甲基树脂)，阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式离子交换，嗜硫吸附(例如用硫醚配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析(例如用苯基-琼脂糖，杂氮-arenophilic树脂，或m-氨基苯硼酸)，金属离子螯合亲和层析(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)，尺寸排阻层析，和电泳方法(比如凝胶电泳，毛细管电泳)(参见例如Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。专利技术概述已经发现，可以使用基于固定化金属离子亲和层析(IMAC)的方法纯化和酶切割包含离子亲和层析标签(亲和标签)和蛋白酶切割位点的多肽原。更准确地来说，已经发现必须将结合于IMAC柱的多肽原与包含尿素的溶液接触(例如清洗)至少一次，以允许之后的工艺步骤进行，即，以使得之后的大规模下游(例如纯化)工艺步骤能够进行的浓度和纯度回收切下的多肽。如本文报道的一个方面是从在其N-或C-末端包含金属离子亲和层析标签和介于所述标签和所述多肽之间的蛋白酶切割位点的多肽原，通过在固定化金属离子亲和层析柱上进行柱上酶切割所述蛋白酶切割位点生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤(以一下步骤)：-变性结合于金属离子层析材料的多肽原，-复性结合于金属离子层析材料的多肽原，和-将结合的多肽原与蛋白酶孵育，从而生产所述多肽。在一个实施方案中，所述变性是通过将结合的多肽原与包含变性剂的溶液相接触。在一个实施方案中，所述复性多肽原是通过将变性的多肽原与无变性剂的溶液相接触。如本文报道的一个方面是从在其N-或C-末端包含金属离子亲和层析标签和介于所述标签和所述多肽之间的蛋白酶切割位点的多肽原，通过在固定化金属离子亲和层析柱上进行柱上酶切割所述蛋白酶切割位点生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤：-将结合的多肽原与包含变性剂的溶液相接触，-任选地，如果用于之前步骤的包含变性剂的溶液无尿素或尿素衍生物，则将结合的多肽原与包含尿素或尿素衍生物的溶液相接触，或如果用于之前步骤的包含变性剂的溶液包含尿素或尿素衍生物和变性剂的混合物，则将结合的多肽原与包含尿素或尿素衍生物的溶液相接触，-通过将结合的多肽原与蛋白酶孵育从固定化金属离子亲和层析柱回收所述多肽并从而生产多肽。在一个实施方案中，所述方法包括在与蛋白酶孵育前直接用无变性剂溶液的清洗步骤。在一个实施方案中，所述金属离子亲和层析标签在多肽的N-末端。在一个实施方案中，在回收步骤前复性所述多肽。在一个实施方案中，以天然形式回收所述多肽。在一个实施方案中，以变性形式回收所述多肽。在一个实施方案中，所述尿素或尿素衍生物具有从约0.5M至约8M的浓度。在一个实施方案中，所述尿素或尿素衍生物具有从约2M至8M的浓度。在一个实施方案中，所述尿素或尿素衍生物具有约4M的浓度。在一个实施方案中，所述变性剂选自盐酸胍，尿素，硫脲，和四甲基脲。在一个实施方案中，所述变性剂是盐酸胍。在一个实施方案中，所述变性剂具有从约0.5M至约6M的浓度。在一个实施方案中，所述变性剂具有从约1.5M至约3M的浓度。在一个实施方案中，所述变性剂具有约2M的浓度。在一个实施方案中，所述变性剂是盐酸胍并具有从约0.5M至约6M的浓度。在一个实施方案中，所述浓度为从约1.5M至约3M。在一个实施方案中，所述浓度为约2M。在一个实施方案中，以天然形式或以变性形式将所述多肽原应用于固定化金属离子亲和层析材料。在一个实施方案中，所述固定化金属离子亲和层析材料是固定化锌亲和层析材料。在一个实施方案中，所述蛋白酶选自IgA蛋白酶，胰蛋白酶，或粒酶B。在一个实施方案中，所述蛋白酶是IgA蛋白酶。在一个实施方案中，所述无变性剂的溶液包含约0.01M至约2M的缓冲剂。在一个实施方案中，所述无变性剂的溶液包含约0.5M至约1.5M的缓冲剂。在一个实施方案中，所述无变性剂的溶液包含约1M至约1.2M的缓冲剂。在一个实施方案中，所述无变性剂的溶液包含pH值为约pH 8的约0.5M至约1.5M Tris。在一个实施方案中，所述无变性剂的溶液包含pH值为约pH 8的约1M至约1.2M Tris。在一个实施方案中，所述多肽是非糖基化的多肽。在一个实施方案中，所述多肽是人载脂蛋白A-I或包含载脂蛋白A-I的融合多肽。在一个实施方案中，所述多肽是四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽。在一个实施方案中，所述多肽为具有选自SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：03的氨基酸序列的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽。在一个实施方案中，所述多肽是人胰岛素样生长因子1(IGF-1)或包含胰岛素样生长因子1(IGF-1)的融合多肽。在一个实施方案中，所述多肽是具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的胰岛素样生长因子1(IGF-1)多肽。如本文报道的一个方面是生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤：-以如本文报道的固定化金属离子亲和层析方法纯化获自包含编码所述多肽的核酸的原核或真核细胞的培养物的培养基的多肽，从而生产所述多肽。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤中的一个或更多个：-培养包含编码所述多肽的核酸的原核或真核细胞，和/或-从所述细胞或/和所述培养基回收所述多肽，和/或-如果以包涵体的形式回收所述多肽，溶解和/或重折叠所述多肽，和/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过在固定化金属离子亲和层析柱上进行蛋白酶切割位点的柱上酶切割从多肽原生产多肽的方法，所述多肽原在其N‑或C‑末端包含金属离子亲和层析标签和介于所述标签和所述多肽之间的所述蛋白酶切割位点，所述方法包括以下步骤：‑变性结合于金属离子亲和层析材料的多肽原，‑复性结合于金属离子亲和层析材料的多肽原，和‑将结合的多肽原与蛋白酶孵育从而生产所述多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.29 EP 12157510.41.一种通过在固定化金属离子亲和层析柱上进行蛋白酶切割位点的
柱上酶切割从多肽原生产多肽的方法，所述多肽原在其N-或C-末端包含
金属离子亲和层析标签和介于所述标签和所述多肽之间的所述蛋白酶切
割位点，所述方法包括以下步骤：
-变性结合于金属离子亲和层析材料的多肽原，
-复性结合于金属离子亲和层析材料的多肽原，和
-将结合的多肽原与蛋白酶孵育从而生产所述多肽。
2.一种通过在固定化金属离子亲和层析柱上进行蛋白酶切割位点的
柱上酶切割从多肽原生产多肽的方法，所述多肽原在其N-或C-末端包含
金属离子亲和层析标签和介于所述标签和所述多肽之间的蛋白酶切割位
点，所述方法包括以下步骤：
-将结合的多肽原与包含变性剂的溶液相接触，
-任选地，如果用于之前步骤的包含变性剂的溶液无尿素或尿素衍生
物，则将结合的多肽原与包含尿素或尿素衍生物的溶液相接触或如果用于
之前步骤的包含变性剂的溶液包含尿素或尿素衍生物和变性剂的混合物，
则将结合的多肽原与包含尿素或尿素衍生物的溶液相接触，
-通过将结合的多肽原与蛋白酶孵育从固定化金属离子亲和层析柱
回收所述多肽，从而生产多肽。
3.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述方法包括
在与蛋白酶孵育前直接用无变性剂的溶液的清洗步骤。
4.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其特征在于以天然形式回
收所述多肽。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯托·法尔肯施泰因，阿德尔伯特·格罗斯曼，弗里德里克·黑塞，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH