大菱鲆肾细胞系的构建方法技术

大菱鲆肾细胞系的构建方法，首先配制细胞培养液，以大菱鲆的肾脏组织为材料，漂洗剪碎后，用０．５％胰蛋白酶室温消化３０分钟，采用２００目尼龙纱网过滤收集细胞，将细胞以５－１０×１０↑［５］个／瓶的量分装至２５ｃｍ↑［２］培养瓶中，置于２４℃培养。以后每隔４天半量更换细胞培养液，待原代细胞生长为单层时，用０．２５％的胰蛋白酶消化细胞进行传代；８－１０天传代１次，传至第８代时，细胞培养液中血清含量由２０％减为１０％，此时细胞系建立成功。利用这种方法获得的大菱鲆肾细胞系形态为成纤维样，可以连续传代４０代以上，细胞系可以直接应用于病原特性研究、疫苗研制及功能基因研究；该构建方法适用于其他鱼类构建肾细胞系。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种大菱鲆肾细胞系的构建方法，其特征在于它的方法包括以下步骤：１）、配制细胞培养液、２）、原代培养、３）、传代培养；　１）、配制细胞培养液：取ＧＩＢＣＯ公司ＭＥＭ培养基，抽滤，分装，４℃保存；用时再加入占所用总体积１０－２０％的胎牛血 清，０．０５％的２－巯基乙醇，２ｎｇ／ｍｌ人碱性成纤维细胞生长因子，４℃存放；　２）、原代培养：取体重约１５０克大菱鲆的肾脏，置于高压灭菌处理的玻璃平皿中，ＰＢＳ冲洗一次，７０％酒精浸泡４分钟，ＰＢＳ冲洗三次，将肾组织剪成大约１ｍｍ↑ ［３］的小块，加入约１０倍组织块体积的０．５％胰蛋白酶，室温消化３０分钟；加入２ｍｌ细胞培养液终止消化，用２００目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，加入２ｍｌ细胞培养液冲洗纱网再过滤一次，将滤过液收集至１５ｍｌ离心管中，以２２００ｒｐｍ离心２分钟，去上清；加２ｍｌ细胞培养液重悬沉淀，以２２００ｒｐｍ再次离心２分钟，去上清；加１ｍｌ细胞培养液重悬细胞沉淀，计数细胞后，按照５－１０×１０↑［５］个／瓶的量分装至２５ｃｍ２的培养瓶中，补充细胞培养液至３ｍｌ，正置于２４℃培养箱中培养；然后每隔４天半量更换细胞培养液一次；　３）、传代培养：原代培养细胞开始增殖后，细胞数目增多，细胞生长成为单层后，以０．２５％胰酶消化法传代悬起细胞，以１∶１－１∶２进行传代；以后８－１０天传代一次；传至第８代时，细胞培养液中血清含量 减为总体积的１０％，此时，细胞系建立成功。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王娜，陈松林，沙珍霞，王贤丽，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]