本发明专利技术提供了一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，属于食品加工技术领域。本发明专利技术以壳聚糖为固定化载体，将壳聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相悬浮法制备壳聚糖微球，然后利用戊二醛为交联剂对壳聚糖微球进行交联活化，将交联活化后的壳聚糖微球与胰蛋白酶溶液混合进行固定化，制得固定化胰蛋白酶。胰蛋白酶是食品工业中蛋白质改性、水解最常用的酶制剂之一，本发明专利技术通过壳聚糖固定化胰蛋白酶，使胰蛋白酶可以重复使用，提高了胰蛋白酶的利用效率，降低了蛋白质水解过程中酶的用量和生产成本，可广泛应用于牛乳、肉类、水产等蛋白质的水解过程与改性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种壳聚糖固定化酶的方法，特别是一种壳聚糖微球固定化胰蛋白方法，属于食品加工
技术背景 胰蛋白酶是食品工业中常用的一种蛋白酶，如在牛乳蛋白的改性，鱼虾、动物蛋白 的酶法水解回收蛋白中均有应用。但是酶制剂通常比较昂贵，且使用过程中酶容易失活且 通常无法再回收利用，因此往往导致生产成本的提高；另外由于酶的不可回收性，也导致在 食品中引入外来物质的风险。而固定化酶能够提高酶的稳定性，能够在较长的时间里保持 活力，并且通过固定化以后能够实现回收利用，大大降低了酶的使用成本，因此固定化胰蛋 白酶具有很重要的现实意义。壳聚糖(chitosan)是甲壳素脱乙酰基的产物，是一种碱性阳 离子多糖，壳聚糖具有很好的成胶性质，易于形成膜、多孔微球、凝胶，可加工成粉、纳米粒 子等多种形态，同时壳聚糖易于进行化学改性，引入新的功能团，如可发生酰基化、羧基化、 醚化、Schiff反应、N-烷基化、酯化、氧化、卤化、接枝共聚等反应，从而制得各种系列衍生物，作为一种天然高分子生物材料。此外，壳聚糖具有良好的机械性能、耐热性、抗菌性以及 生物相容性和生物降解性，安全可靠，对人类无害并且对环境无污染。因此，壳聚糖及其衍 生物是一类性能优良的固定化酶载体。Krajewska研究了过去十年中壳聚糖在固定化酶方 面的应用，以多种形态的壳聚糖作为载体，已经用于63种酶的固定化。国内已有很多关于 壳聚糖固定化酶的报道，如公开号CN1285403A公布了一种壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶 的方法，公开号CN101113433的专利公开了一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺，公开 号CN101285060A则公布了一种壳聚糖_精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法。 关于用壳聚糖固定化胰蛋白酶国内外已有报道，但固定化采用的方法各不相同，如采用壳 聚糖吸附戊二醛交联的方法固定胰蛋白酶，还有采用采用交联-吸附法对胰蛋白酶的固定 化。正如公开号CN101285060A专利中所提到的，先前的一些研究大多存在一些缺陷，如得 到的产品杂质多、活力低等。有利于降低生产成本。壳聚糖是一种天然高分子生物材料，具 有良好的生物相容性和生物降解性，安全可靠，对人类无害并且对环境无污染，用其固定化 胰蛋白酶，无残留、安全性高。本专利技术提供了，使胰 蛋白酶可以重复使用，提高了胰蛋白酶的利用效率，降低了蛋白质水解过程中酶的用量和 生产成本，可广泛应用于牛乳、肉类、水产等蛋白质的水解过程与改性。
技术实现思路
本专利技术的目的提供了，通过壳聚糖固定 化胰蛋白酶，使胰蛋白酶可以重复使用，提高胰蛋白酶的利用效率，降低蛋白质水解过程中 酶的用量和生产成本，同时增大壳聚糖的应用范围，为壳聚糖资源的推广应用提供依据。本专利技术的技术方案，是以壳聚糖为固定 化载体，将壳聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相悬浮法制备壳聚糖微球，然后利用戊二醛3为交联剂对壳聚糖微球进行交联活化，将交联活化后的壳聚糖微球与胰蛋白酶溶液混合进 行固定化，制得固定化胰蛋白酶。具体制备方法如下 (1)壳聚糖微球的制备及活化称取一定量的壳聚糖溶于质量浓度1% _3%的醋 酸溶液中，制得质量浓度为2% _4%的壳聚糖溶液。接着加入液体石蜡和span-80和致孔 剂乙酸乙酯，高速搅拌的情况下缓慢加入壳聚糖溶液，保持高速搅拌40-100min，使壳聚糖 液滴均匀分散，得到悬浮的乳状液，然后缓慢往乳状液中加入戊二醛溶液，使乳状液中戊二 醛的质量浓度达到2% _6%，在4-451:下交联活化l-10h，静置冷却后，将所得乳状液倒入 等体积的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振荡，而后静置，弃去油层和水层，最后用去离子 水反复洗涤抽滤至中性，得到活化的壳聚糖微球； (2)固定化酶的制备用pH6. 0-7. 0的磷酸盐缓冲溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋 白酶/壳聚糖微球为0. 5mg/g-4mg/g的比例将胰蛋白酶溶液与壳聚糖微球混合，搅拌均匀 后于4t:冰箱中静置5-24h，用pH6. 0-7. 0的缓冲液抽洗至滤液中检测不到蛋白质存在即得 到固定化胰蛋白酶。 所述的span-80用量为石蜡质量的0. 1% _1 % ，致孔剂乙酸乙酯的用量为石蜡质 量的0.01%-0. 1%，壳聚糖溶液/石蜡质量比为1 : 1.5-1 : 3。 所述的NaOH/乙醇混合液为l_2mol/L的NaOH溶液与乙醇按照体积比1 : 1混合而成的混合液。 本专利技术的有益效果 壳聚糖(chitosan)是一种天然高分子生物材料，具有良好的生物相容性和生物 降解性，安全可靠，用其固定化胰蛋白酶，安全性高，无残留，对人类无害并且对环境无污染 本专利技术提供了。本专利技术通过壳聚糖固定化 胰蛋白酶，使胰蛋白酶可以重复使用，提高了胰蛋白酶的利用效率，降低了蛋白质水解过程 中酶的用量和生产成本，可广泛应用于牛乳、肉类、水产等蛋白质的水解过程与改性。 本专利技术得到的固定化胰蛋白酶活力高，酶活回收率高达到73.32%，操作稳定性 好，连续操作7批，活力保持80%以上。具体实施方式 实施例1 (1)壳聚糖微球的制备称取一定量的壳聚糖溶于质量浓度1%的醋酸溶液中，制 得质量浓度为2%的壳聚糖溶液。在容器中加入液体石蜡、span-80和致孔剂乙酸乙酯， span-80用量为石蜡质量的0. 5%，致孔剂乙酸乙酯用量为石蜡质量的0. 01% ;高速搅拌的 情况下缓慢加入壳聚糖溶液，壳聚糖溶液/石蜡质量比为l : 1.5，保持高速搅拌40min，使 壳聚糖液滴均匀分散，得到悬浮的乳状液；然后在搅拌的情况下往乳状液中缓慢加入戊二 醛溶液，使乳状液中戊二醛质量浓度达到1%，在45t:下反应lh。静置冷却后，将所得乳状 液倒入等体积的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振荡，而后静置，弃去油层和水层，最后用 去离子水反复洗涤抽滤至中性，得到活化的壳聚糖微球。所用NaOH/乙醇混合液为lmol/L 的NaOH溶液与乙醇按照体积比1 : l混合而成的混合液。 (2)固定化酶的制备用pH6. 0的磷酸盐缓冲溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶 /壳聚糖微球0. 5mg/g的比例将胰蛋白酶溶液与壳聚糖微球混合，搅拌均匀后于4t:冰箱中4静置5h，用pH6. 0的缓冲液抽洗至滤液中检测不到蛋白质存在即得到固定化胰蛋白酶。 实施例2 (1)壳聚糖微球的制备称取一定量的壳聚糖溶于质量浓度2%的醋酸溶液中，制 得质量浓度为3%的壳聚糖溶液。在容器中加入液体石蜡、span-80和致孔剂乙酸乙酯， span-80用量为石蜡质量的0. 1 %，致孔剂乙酸乙酯用量为石蜡质量的0. 05% ;高速搅拌的 情况下缓慢加入壳聚糖溶液，壳聚糖溶液/石蜡质量比为l : 2，保持高速搅拌60min，使壳 聚糖液滴均匀分散，得到悬浮的乳状液；然后在搅拌的情况下往乳状液中缓慢加入戊二醛 溶液，使乳状液中戊二醛质量浓度达到6%，在fC下反应10h。静置冷却后，将所得乳状液 倒入等体积的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振荡，而后静置，弃去油层和水层，最后用去 离子水反复洗涤抽滤至中性，得到活化的壳聚糖微球。所用NaOH/乙醇混合液为2mol/L的 NaOH溶液与乙醇按照体积比1 : l混合而成的混合液。 (2)固定化酶的制备用pH7. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，其特征是以壳聚糖为固定化载体，将壳聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相悬浮法制备壳聚糖微球，然后利用戊二醛为交联剂对壳聚糖微球进行交联活化，将交联活化后的壳聚糖微球与胰蛋白酶溶液混合进行固定化，制得固定化胰蛋白酶； 所述的壳聚糖微球的制备及活化：称取一定量的壳聚糖溶于质量浓度１％－３％的醋酸溶液中，制得质量浓度为２％－４％的壳聚糖溶液，在容器中加入液体石蜡和ｓｐａｎ－８０和致孔剂乙酸乙酯，高速搅拌的情况下缓慢加入壳聚糖溶液，保持高速搅拌４０－１００ｍｉｎ，使壳聚糖液滴均匀分散，得到悬浮的乳状液。然后缓慢往乳状液中加入戊二醛溶液，使乳状液中戊二醛的质量浓度达到２％－６％，在４－４５℃下交联活化１－１０ｈ，静置冷却后，将所得乳状液倒入等体积的ＮａＯＨ／乙醇混合液中，充分混合振荡，而后静置，弃去油层和水层，最后用去离子水反复洗涤抽滤至中性，得到活化的壳聚糖微球； 所述的固定化酶的制备：用ｐＨ６．０－７．０的磷酸盐缓冲溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶／壳聚糖微球为０．５ｍｇ／ｇ－４ｍｇ／ｇ的比例将胰蛋白酶溶液与壳聚糖微球混合，搅拌均匀后于４℃冰箱中静置５－２４ｈ，用ｐＨ６．０－７．０的缓冲液抽洗至滤液中检测不到蛋白质存在即得到固定化胰蛋白酶。...
【技术特征摘要】
一种壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，其特征是以壳聚糖为固定化载体，将壳聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相悬浮法制备壳聚糖微球，然后利用戊二醛为交联剂对壳聚糖微球进行交联活化，将交联活化后的壳聚糖微球与胰蛋白酶溶液混合进行固定化，制得固定化胰蛋白酶；所述的壳聚糖微球的制备及活化称取一定量的壳聚糖溶于质量浓度1％-3％的醋酸溶液中，制得质量浓度为2％-4％的壳聚糖溶液，在容器中加入液体石蜡和span-80和致孔剂乙酸乙酯，高速搅拌的情况下缓慢加入壳聚糖溶液，保持高速搅拌40-100min，使壳聚糖液滴均匀分散，得到悬浮的乳状液。然后缓慢往乳状液中加入戊二醛溶液，使乳状液中戊二醛的质量浓度达到2％-6％，在4-45℃下交联活化1-10h，静置冷却后，将所得乳状液倒入等体积的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振荡，而后静置，弃去油层和水层，最后...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏文水，谭丽，姜启兴，
申请(专利权)人：武汉工业学院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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