茶多酚与壳聚糖配伍用于制备猪精液保存用稀释液的应用制造技术

本发明专利技术涉及茶多酚与壳聚糖配伍作为猪精液保存用稀释液的应用。本发明专利技术的猪精液常温保存的抗氧化剂，由于采用了茶多酚与壳聚糖配伍作为抗氧化剂，两者之间存在依赖性的协同关系，适当浓度的茶多酚与壳聚糖配伍才能够在猪精液常温保存过程中很好地保护猪精子的生理活性。

Application of tea polyphenol and chitosan in preparing diluting liquid for boar semen preservation

The present invention relates to the application of tea polyphenol and chitosan as diluting liquid for boar semen preservation. Room temperature preservation of boar sperm antioxidant of the invention, due to the use of tea polyphenols and compatibility of chitosan as antioxidants, synergistic dependent relationship between tea polyphenols and chitosan with proper concentration can be in normal porcine semen preservation process well protect the pig sperm physiological activity.

【技术实现步骤摘要】
茶多酚与壳聚糖配伍用于制备猪精液保存用稀释液的应用
本专利技术涉及用于制备猪精液常温保存的茶多酚与壳聚糖配伍稀释液配方及其最佳配伍浓度，可有效提高精液保存效果，并能有效降低精液中细菌的含量，提高精液中抗氧化酶的活性。
技术介绍
猪精液的常温保存有效的延长了精子的体外保存时间，切实提高良种公猪的种用价值，降低生殖系统疾病的发生，促进猪人工授精技术的发展和应用。由于常温保存稀释粉配方是决定猪精液常温保存效果的关键，而目前国内猪精液常温保存稀释粉配方仍无法完全打破国外的垄断，因而猪精液的常温保存需要更加高效稳定的稀释粉。但是，稀释粉配方中所用保护剂的种类及用量是决定精液稀释后保存效果的核心，且与其他成分的比例及配伍将直接关系到保存后精子的生理状态和活性。活性氧(ROS)是细胞需氧代谢过程中产生的不稳定代谢产物(任俊玲等2013)。哺乳动物精液本身存在一定的ROS防御系统(Awdaetal.2009)，主要为酶类抗氧化系统，包括SOD、CAT和GSH-PX。虽然不同物种间的抗氧化酶活性不尽相同(Strzezeketal.2002)，但对于同一动物而言，SOD活性能反映整个系统抗氧化酶的水平，SOD活性越高，抗氧化能力越强。虽然CAT和GSH-PX在SOD清除自由基的过程中发挥协助作用，但CAT和GSH-PX活性也从侧面反映该系统的抗氧化水平(Orzoleketal.2013)。因此，实验室检测细胞代谢系统中抗氧化水平通常采用SOD、CAT和GSH-PX试剂盒检测其活性。H2O2是氧自由基的一种，过量的H2O2会对细胞造成损伤。对于精子细胞而言，会破坏精子的受精能力，因而机体内H2O2的含量也可以作为精子质膜过氧化损伤的检测指标。通过测定这些指标的变化，反映精子在稀释液环境中的生存情况。精液的常温保存是一项在17℃条件下，通过添加稀释液来延长精子体外存活时间的技术。精子顶体蛋白酶在17℃能够达到最佳活性(Pinart2013)。由于精子在17℃环境下能够进行正常的代谢活动，产生有害物质，因而稀释液中往往需要添加相应的抗氧化剂或其他药物，如青链霉素等，保持其微环境的相对稳定性。
技术实现思路
本专利技术以茶多酚(TPP)和壳聚糖(CS)作为抗氧化剂的主要成分，通过联合添加不同浓度的茶多酚和壳聚糖，以稀释后精子的活率、质膜完整率、精液中的MDA含量、CAT活性、SOD活性、GSH-Px活性及细菌含量为评定指标，筛选茶多酚和壳聚糖的最佳配伍浓度，以保证猪精液在常温保存过程中维持良好的生物活性。本专利技术提供了茶多酚与壳聚糖配伍作为猪精液常温保存用稀释液的应用。本专利技术还提供了一种猪精液常温保存用稀释液，该常温保存稀释液包含茶多酚与壳聚糖。进一步，本专利技术的猪精液常温保存用稀释液组分为：每1L所述猪精液常温保存用稀释液的配方为：茶多酚0.02g，壳聚糖0.05g，葡萄糖38g，柠檬酸钠6.5g，EDTA1.2g，碳酸氢钠1g，柠檬酸0.25g，氯化钾0.6g，β-环糊精0.9g，其余为超纯水。本专利技术的猪精液常温保存的抗氧化剂，由于采用了茶多酚与壳聚糖配伍作为抗氧化剂，两者之间存在依赖性的协同关系，适当浓度的茶多酚与壳聚糖配伍能够在猪精液常温保存过程中很好地保护猪精子的生理活性。附图说明图1为不同浓度的茶多酚-壳聚糖配伍对常温(17℃)保存猪精液SOD活性的影响；图2为不同浓度的茶多酚-壳聚糖配伍对常温(17℃)保存猪精液CAT活性的影响；图3为不同浓度的茶多酚-壳聚糖配伍对常温(17℃)保存猪精液GSH-PX活性的影响；图4为不同浓度的茶多酚-壳聚糖配伍对常温(17℃)保存猪精液细菌含量的影响。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。按照本专利技术的技术方案，本实施例给出一种用于猪精液常温保存的茶多酚与壳聚糖配伍稀释液配方。其中：稀释液的配方为：茶多酚0.02g/L，壳聚糖0.05g/L，葡萄糖38g/L，柠檬酸钠6.5g/L，EDTA1.2g/L，碳酸氢钠1g/L，柠檬酸0.25g/L，氯化钾0.6g/L，β-环糊精0.9g/L(表1)。表1茶多酚与壳聚糖配伍稀释液配方试验具体过程如下：根据表1的稀释液配方，称取38g葡萄糖，6.5g柠檬酸钠，1.2gEDTA，1g碳酸氢钠，0.25g柠檬酸，0.6g氯化钾，0.9gβ-环糊精，分别称取0g、0.01g、0.02g、0.04g茶多酚和0g、0.05g、0.1g壳聚糖。茶多酚与壳聚糖按照表2配伍方案添加，于250mL灭菌烧杯中溶解后定容于1000mL容量瓶，1h后在无菌操作台中用无菌过滤器配合0.22μm滤菌膜过滤溶液，即得到茶多酚与壳聚糖的质量浓度，配制好的稀释液待用。表2茶多酚和壳聚糖配伍稀释液配方本试验所用猪精液来自20月龄杜洛克种公猪。将利用手握法采集到的精液过滤后放入保温箱，迅速带回实验室。选取色泽和气味正常，精子活率在85％以上的精液待用。取2mL精液于无菌10mL离心管中，再缓慢添加稀释液至管口，4层毛巾包裹离心管，待精液温度与室温接近时放入17℃恒温箱中保存6d，每隔12h缓慢翻动精液1次，每隔24h检查精子活率(以精子活率为60％的天数为有效保存时间)、质膜完整率；分别在精液保存0、2、4、6d时检测精液中的细菌含量。每个处理重复3次。精子活率、质膜完整率、SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性及细菌含量的测定结果以表和的图形式表示。表3不同剂量的茶多酚和壳聚糖配伍后的猪精子活率(％)表4不同剂量的茶多酚和壳聚糖配伍后的猪精子质膜完整率(％)由表3可以看出，除T3C2和T3C0外，其他配伍处理组精子有效保存时间均能达到6d，且保存6d时精子活率与对照组差异显著(P＜0.05)；T2C1组在整个保存过程中精子活率最高，且显著高于单独添加茶多酚或壳聚糖处理组；保存6d时精子活率为67.40％，显著高于其他各组(P＜0.05)。随着组合浓度的增加，高浓度组T3C2保存6d时精子活率最低，因此该浓度组合不利于精液保存。由表4可以看出，精子质膜完整率随保存时间降低，常温保存1d时各处理组质膜完整率差异不显著(P＞0.05)；从保存第2d开始，联合添加茶多酚与壳聚糖的处理组精子质膜完整率显著高于单独添加茶多酚的处理组；常温保存2～5d，除T3C2外其余处理组质膜完整率显著高于对照组(P＜0.05)，但处理组间大多差异不显著(P＞0.05)；保存6d后，T2C1组质膜完整率最高，显著高于单独使用茶多酚处理组(P＜0.05)，但与单独使用壳聚糖处理组差异不显著(P＞0.05)，T3C2处理组质膜完整率最低，显著低于其他处理组(P＜0.05)。由图1可以看出，各处理组SOD活性随保存时间降低，保存2d后T1C2、T2C1、T2C2组均高于单独添加茶多酚和壳聚糖的T0C2和T3C0组，但差异不显著(P＞0.05)；保存4d后T2C1组依然保持最高SOD活性，但差异不显著(P＞0.05)；保存6d后SOD活性最高的两组为T2C1和T2C2，且显著高于其他处理组(P＜0.05)，其中T2C1高于T2C2，但两组间差异不显著(P＞0.05)。由图2可知，T2C1处理组有助于提高猪精液常温保存中CAT活性。通过3次测量数据表明，T2C1处理组的CAT活性显著高于单独本文档来自技高网...

【技术保护点】
茶多酚与壳聚糖配伍作为猪精液常温保存用稀释液的应用。

【技术特征摘要】
1.茶多酚与壳聚糖配伍作为猪精液常温保存用稀释液的应用。2.一种猪精液常温保存用稀释液，其特征在于，该常温保存稀释液包含茶多酚与壳聚糖。3.如权利要求2所述的猪精液常温保存用稀释液，其特征在于，该常温保存稀释液组分...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡建宏，方乾，谢东淇，李浩，李宇，贾永宏，杜忍让，杨公社，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61