类胰蛋白酶抑制剂制造技术

本发明专利技术涉及在蜱中鉴定出的新型蛋白酶抑制剂蛋白。这些蛋白可用作疫苗组分、肥大细胞类胰蛋白酶抑制剂、用于检测肥大细胞以及分离纯化肥大细胞类胰蛋白酶。本发明专利技术还涉及控制动物和人体内由寄生物引起的疾病和损伤，而且涉及本发明专利技术蛋白在治疗某些疾病和变态反应方面的用途。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在蜱中鉴定出的新型蛋白。这些蛋白可用作疫苗组分、肥大细胞类胰蛋白酶(此后称为MCT)抑制剂、用于检测肥大细胞以及分离纯化MCT。本专利技术还涉及控制寄生物引起的动物和人类疾病和损伤，以及涉及本专利技术蛋白在治疗疾病和变态反应中的应用。在文章中提及以及在本说明书结尾列出的所有文献均通过引用结合到本文中。人MCT是一种存储在肥大细胞分泌颗粒中的内切蛋白酶，一旦激活则作为肝素稳定化四聚体由肥大细胞释放。去除肝素导致类胰蛋白酶复合物解离为酶失活单体(Schwartz，1994)。类蛋白酶是人肥大细胞颗粒的主要蛋白介导物成分，占总细胞蛋白的20％以上(Schwartz，1994)。MCT是肥大细胞的特异性标志，使肥大细胞与嗜碱性粒细胞区分开来。肥大细胞见于许多组织，但沿着机体上皮层(如皮肤、呼吸道和胃肠道)存在的数目较多。肥大细胞通过位于小血管附近。它们参与各种生理和病理生理状态，包括急性炎症、即发型超敏反应、迟发型超敏反应、细胞生长调节、防御瘤形成以及痛觉和发痒(Liang等，1998)。肥大细胞还影响慢性炎症状态和参与神经免疫作用(Leon等，1994)。肥大细胞类胰蛋白酶是一种重要的炎症介质。实验(主要在体外进行)表明，它在诸如哮喘、牛皮癣、间质性肺炎、类风湿性关节炎、齿龈炎和牙周炎的疾病中起重要作用。肥大细胞类胰蛋白酶还由于其激活尿激酶原和基质金属蛋白酶溶基质素原的潜能而参与肿瘤发生和血管发生。还描述了类胰蛋白酶样酶参与激活和内化致病病毒，如流感病毒、副流感病毒和人免疫缺陷病毒(Pohlig等，1996)。小分子量物质(例如亮抑蛋白酶肽和二异丙基氟磷酸)抑制人类胰蛋白酶。二价阳离子(如钙离子)和苄脒及其衍生物是人肥大细胞类胰蛋白酶的竞争性抑制剂(Schwartz，1994)。然而，与大多数其它丝氨酸酯酶不同，人类胰蛋白酶不受典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂(如抑蛋白酶肽和大豆胰蛋白酶抑制剂)抑制。还报道了针对肥大细胞类胰蛋白酶催化部位的内源性抑制剂。乳铁蛋白和髓过氧化物酶(均来源于嗜中性粒细胞)以及抗凝血酶III抑制人类胰蛋白酶活性，所有这些抑制剂都拮抗稳定MCT四聚体的粘多糖(肝素或硫酸软骨素)(Alter等，1990；Cregar等，1999；Elrod等，1997)。先前已经描述了水蛭来源的人类胰蛋白酶抑制剂(LDPI)。已发现重组形式的Kazal型蛋白有效抑制四聚体类胰蛋白酶4个催化部位中的2个部位(Stubbs等，1997；Auerswald等，1994；Mühlhahn等，1994；Sommerhoff等，1994)。由于已知MCT在哺乳动物疾病和变态反应中的重要性，因此确实需要针对MCT的高度特异性的有效抑制剂。现在在蜱物种中发现了一种能够抑制人肥大细胞类胰蛋白酶活性的新型蛋白。本文使用的术语“显著序列同源性”是指包括所有与TdPI具有共同功能并具有共同的序列同源性或在多肽序列中存在的基序之间具有共同同源性的蛋白。“显著的”整体同源性是指如果将所述同源蛋白与TdPI序列进行序列对比，则在完全保守的序列中有50％或50％以上的氨基酸为相同残基。最好使用GCG最佳拟合命令(空位生成罚分＝2.5；空位延长罚分＝0.5)(Genetics-Computer-Group，1994)进行序列对比。所述蛋白完整长度上的同源性程度优选为至少60％。更优选同源性程度为至少70％，甚至更优选为75％，最优选为80％或更高。本专利技术在该方面包括提供含本文鉴定为蜱源性蛋白酶抑制剂蛋白(TdPI)的序列的蛋白、其活性片段或其功能等同物。附附图说明图1给出了该序列。经鉴定，该蛋白由蜱唾液腺文库的cDNA编码。该蛋白的分子量约13.5kDa，看来属于Kunitz型蛋白酶抑制剂家族。所述序列与与该家族其它成员如抑蛋白酶肽和间α-胰蛋白酶(inter-alpha-trypsin)抑制剂的相似性低，但推定的反应中心和半胱氨酸位置在一定程度上保守。术语“功能等同物”在本文用于描述与TdPI蛋白在抑制类胰蛋白酶或具有一个或多个可用于开发疫苗的表位方面具有相似功能的蛋白，所述疫苗针对与TdPI具有显著序列同源性的蛋白。术语“功能等同物”还指在结构上与本文鉴定的TdPI蛋白相似或含有相似或相同三级结构的分子。该术语还包括保留抑制类胰蛋白酶(优选人肥大细胞类胰蛋白酶)能力的蛋白片段。抑制类胰蛋白酶的相似功能最好针对类胰蛋白酶(优选肥大细胞类胰蛋白酶，更优选人肥大细胞类胰蛋白酶)的催化活性，其特征在于Ki小于1μM，更优选小于100nM，甚至更优选小于20nM，甚至更优选小于10nM，最优选小于1nM，可使用如本文描述的任何标准类胰蛋白酶抑制测定评价(参见以下实施例中标题为“蛋白酶抑制测定”的部分)。或者，或者除了具有抑制类胰蛋白酶活性之外，“功能等同物”在本文用于描述含有表位的蛋白，所述表位可用于开发针对本专利技术蛋白的疫苗。这样的功能等同物以及含有合适表位的片段，可用于开发针对吸血寄生物的疫苗，该疫苗针对TdPI蛋白家族成员。当然，可制备免疫原性高于或低于对应的野生型蛋白或蛋白片段的功能等同物，以便适于需要的用途。所述“野生型”是指大多数种成员特征性天然存在的基因型。如果所述蛋白用于诱导针对寄生物蛋白的宿主抗性的免疫接种方案，则可以修饰所述分子，以便增强它们的免疫原性。因此，它们更可能在接种的宿主中激发免疫应答。本专利技术蛋白的功能等同物相对于野生型蛋白序列存在取代、添加、插入和/或缺失一个或多个氨基酸以及化学修饰氨基酸的取代，而不以相反的方式影响所述蛋白的功能或活性。该术语还包括天然生物变异体(例如所有产生野生型蛋白的不同物种的等位基因变异体或地理变异)。“活性”片段是或者抑制类胰蛋白酶(优选人肥大细胞胰蛋白酶)和/或包含一个或多个可用于开发针对本专利技术蛋白的疫苗的表位的片段。这些生物特性如上所述。本专利技术这一方面的蛋白优选得自吸血外寄生物(如蚊或水蛭)或有毒动物(如蜘蛛、蝎子或蛇)。所述蛋白更优选得自蜱，最优选得自硬蜱(Ixodid tick)，如非洲扇头蜱(Rhipicephalus appendiculatus)。按照本专利技术的第二方面，提供抑制类胰蛋白酶的得自吸血节肢动物外寄生物的重组蛋白、其活性片段或其功能等同物。所述重组蛋白优选得自蜱，最优选得自硬蜱(Ixodid tick)，如非洲扇头蜱。这些分子在抑制类胰蛋白酶(优选肥大细胞类胰蛋白酶，更优选人肥大细胞类胰蛋白酶)催化活性方面具有活性，其特征在于Ki小于1μM，更优选小于100nM，更优选小于20nM，甚至更优选小于10nM，最优选小于1nM或更小。本专利技术上述方面的蛋白的衍生物包括在本专利技术的实施方案中。这样的衍生物可包括在其氨基-或羧基-末端融合或内部加成的其它蛋白或多肽。其它多肽可用于帮助检测、表达、分离或纯化所述蛋白或可用于赋予所述蛋白其它的需要特性。潜在融合配偶体的实例包括β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、荧光素酶、聚组氨酸标记、T7聚合酶片段和分泌信号肽。可使用已知的分子生物学和蛋白质化学技术制备本专利技术的蛋白。可通过化学合成(一种特别用于产生衍生自全长蛋白序列的短肽的技术)制备用作免疫原的蛋白片段。可通过在宿主细胞中表达制备重组形式的本专利技术的蛋白。这样本文档来自技高网...

【技术保护点】
与图１所示的蜱源性蛋白酶抑制剂蛋白（ＴｄＰＩ）序列具有显著序列同源性的重组蛋白、该蛋白的活性片段或该蛋白的功能等同物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PA努塔尔，GC佩森，
申请(专利权)人：发展技术有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]