双阿司匹林交联聚乙二醇化血红蛋白制造技术

本发明专利技术描述了具有高氧亲和力的聚乙二醇化双阿司匹林交联血红蛋白缀合物，其具有增强的亚硝酸盐还原酶活性，用于将氧、一氧化碳、氧化氮或其混合物递送到组织中以治疗各种疾病和病状。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术大体上涉及用于在微血管系统中与天然血红蛋白相比以提高的速率将亚硝酸盐还原为氧化氮的交联聚乙二醇化血红蛋白和血红蛋白组合物。具体地说，本专利技术是针对使用具有提高的亚硝酸盐还原酶活性并且还可以将氧、一氧化碳、氧化氮或其混合物递送到组织中的高氧亲和力分子内交联聚乙二醇化血红蛋白缀合物。专利技术背景基于血红蛋白的氧载体(“HBOC”)一直被与血管收缩相联系，所述血管收缩已被归因于血红素对氧化氮(NO)的清除作用。适合作为氧治疗剂的氧载体(有时称为“携带氧的血浆容量扩张剂”)(诸如稳定化血红蛋白(Hb))已显示具有有限的功效，因为其清除氧化氮，从而引起血管收缩和高血压。这些携带氧的解决方案引起血管收缩的倾向可在动物和人类中显现为高血压。尽管HBOC的血管收缩作用的潜在机制尚未充分了解，但已表明血红素铁可快速并且不可逆地与内源性NO(一种强大的血管扩张剂)组合，从而引起血管收缩。部分因为这些血管收缩作用，迄今为止尚无氧载体作为氧治疗剂(OTA)完全成功，不过包含修饰型无细胞Hb的产品已成为最有前景的产品。美国军队研发了用双二溴水杨基-富马酸酯的α链间交联的人Hb(ααHb)作为原型红细胞替代物，但在其展现肺及全身血管阻力剧烈增加之后被放弃(Hess，J.等，1991，Blood 78：356A)。此产品的商业形式在令人失望的III期临床试验之后也被放弃(Winslow，R.M.，2000，Vox Sang 79：1-20)。已提出两种分子途径，试图克服Hb的NO结合活性。第一种途径使用远端血红素口袋的定位诱变，以求形成NO结合亲和力降低的重组血红蛋白(Eich，R.F.等，1996，35：6976-83)。第二种途径使用化学修饰途径，其中通过寡聚化增加Hb的大小，以求降低或有可能完全抑制Hb从血管间隔中溢出进入胞间隙(Hess，J.R.等，1978，J.Appl.Physiol.74：1769-78；Muldoon，S.M.等，1996，J.Lab.Clin.Med.128：579-83；Macdonald，V.W.等，1994，Biotechnology 22：565-75；Furchgott，R.，1984，Ann.Rev.Pharmacol.24：175-97；以及Kilbourne，R.等，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.199：155-62)。事实上，已产生对NO的关联结合速率降低的重组Hb，其在最大负荷大鼠实验中更少产生高血压(Doherty，D.H.等1998，Nature Biotechnology 16：672-676以及Lemon，D.D.等1996，Biotech 24：378)。然而，研究表明NO结合可能不是Hb的血管活性的唯一解释。已发现某些大Hb分子(诸如用聚乙二醇(PEG)修饰的大Hb分子)实际上无血管收缩，尽管其NO缔合速率与严重高血压ααHb的NO缔合速率目同(Rohlfs，R.J.等1998，J Biol.Chem.273：12128-12134)。此外，发现当在出血之前作为交换输血提供时PEG-Hb预防出血结果格外有效(Winslow，R.M.等1998，J.Appl.Physiol.85：993-1003)。PEG缀合至Hb使其抗原性降低并且延长其循环半衰期。然而，已报导PEG缀合反应引起Hb四聚体解离成αβ-二聚体亚基，从而在接受低于40，000道尔顿(“Da”)的Hb单体单元的PEG-缀合物的交换输血大鼠中引起严重的血红蛋白尿(Iwashita和Ajisaka Organ-Directed Toxicity：Chem.Indicies Mech.，Proc.Symp.，Brown等1981，编著Pergamon，Oxford，England第97-101页)。分子量大于84，000道尔顿的聚环氧烷(“PAO”)缀合Hb是由Enzon，Inc.(美国专利号5，650，388)制备，其携带约10个拷贝的在α和ε氨基处键联至Hb的PEG-5,000链。此取代度描述为避免在哺乳动物中与血红蛋白尿有关的临床上显著的肾毒性。然而，缀合反应产生异质缀合群体并且含有其它不合需要的反应物，其必须通过柱色谱法去除。PEG缀合典型地通过用生物分子表面上的官能团活化PEG部分的反应来进行。最常见的官能团是赖氨酸的氨基、组氨酸残基的咪唑基以及蛋白质的N端；半胱氨酸残基的硫醇基；以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基以及蛋白质的C端。通常通过将羟基端转化成能够在温和水性环境中与这些官能团反应的反应性部分来活化PEG。用于缀合治疗性生物药物的最常见单官能PEG之一是甲氧基-PEG(“mPEG-OH”)，其仅具有一个官能团(即羟基)，因此使与双官能PEG有关的交联和聚集问题减到最少。然而，mPEG-OH往往被高分子量双官能PEG(即“PEG二醇”)污染，归因于其生产过程其可在高达10至15％范围内(Dust J.M.等1990，Macromolecule 23：3742-3746)。此双官能PEG二醇的大小是所需单官能PEG的大致两倍。随着PEG的分子量增加污染问题进一步加重。mPEG-OH的纯度对于聚乙二醇化生物治疗剂的产生尤其关键，因为FDA要求最终药物产品的生产过程和质量的高水平的再现性。Hb已以氧合与脱氧状态两者缀合至PAO。美国专利号6,844,317描述了通过在缀合之前将Hb与大气平衡来以氧合或“R”态对Hb进行缀合，以提高所得PEG-Hb缀合物的氧亲和力。其它描述了在缀合之前用于减小氧亲和力并且增加结构稳定性的脱氧步骤，从而使Hb能够承受化学修饰、透滤和/或无菌过滤以及巴氏灭菌法的物理应力(美国专利号5,234,903)。关于Hb的分子内交联，表明可能需要在修饰之前使Hb脱氧以使α链的赖氨酸99暴露于交联试剂(美国专利号5,234,903)。Acharya等研究了在与PEG缀合之前用2-亚氨基硫杂环戊烷进行Hb硫醇化的动力学(美国专利号7,501，499)。观察到使亚氨基硫杂环戊烷的浓度从10倍(其引入平均五个非固有硫醇/四聚体)增加到30倍使Hb上非固有硫醇的数目几乎加倍。然而，PEG缀合之后所见的尺寸增加仅是微小的，甚至在硫醇数目加倍的情况下也是如此。这表明在20倍摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000存在下的缀合反应以更少反应性硫醇覆盖Hb的表面，从而产生空间干扰，其抵抗更多反应性硫醇对H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β，β‑分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物，其P50如在37℃和pH 7.4下所测量在约2至5mmHg范围内，其中当在25℃下完全脱氧时所述血红蛋白缀合物展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为至少10倍。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.29 US 61/617,6391.一种β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物血红蛋白缀合物，其P50
如在37℃和pH 7.4下所测量在约2至5mmHg范围内，其中当在25℃
下完全脱氧时所述血红蛋白缀合物展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其
比脱氧无基质血红蛋白在相同条件下测量时大为至少10倍。
2.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀
合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血
红蛋白在相同条件下测量时大为至少15倍。
3.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀
合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血
红蛋白在相同条件下测量时大为至少20倍。
4.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀
合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血
红蛋白在相同条件下测量时大为10倍至约25倍。
5.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀
合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血
红蛋白在相同条件下测量时大为约15倍至约25倍。
6.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀
合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血
红蛋白在相同条件下测量时大为10倍至约21倍。
7.如权利要求1所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白缀
合物当完全脱氧时展现最大亚硝酸盐还原酶活性，其比脱氧无基质血
红蛋白在相同条件下测量时大为约15倍至约21倍。
8.一种β，β-分子内交联聚氧化烯氧化物(PAO)血红蛋白缀合物，
其P50如在37℃和pH 7.4下所测量在约2.0至5.0mmHg范围内，当
在25℃下完全脱氧时所述血红蛋白缀合物的最大亚硝酸盐还原酶活
性是至少0.25μM/秒。
9.如权利要求8所述的血红蛋白缀合物，其中最大亚硝酸盐还
原酶活性是至少约0.30μM/秒。
10.如权利要求8所述的血红蛋白缀合物，其中最大亚硝酸盐还
原酶活性是至少约0.35μM/秒。
11.如权利要求8所述的血红蛋白缀合物，其中最大亚硝酸盐还
原酶活性是至少约0.40μM/秒。
12.如权利要求8所述的血红蛋白缀合物，其中最大亚硝酸盐还
原酶活性在0.25至约0.50μM/秒范围内。
13.如权利要求8所述的血红蛋白缀合物，其中最大亚硝酸盐还
原酶活性在0.30至约0.47μM/秒范围内。
14.如权利要求1-13中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述
血红蛋白缀合至平均约7至约11个PAO分子/四聚体。
15.如权利要求14所述的血红蛋白缀合物，其中所述血红蛋白
缀合至平均约9至约10个PAO分子/四聚体。
16.如权利要求1-15中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中当所
述血红蛋白呈氧合状态时所述聚环氧烷经由硫醇反应性部分共价连
接至血红蛋白分子上暴露的氨基酸侧链的硫醇基。
17.如权利要求16所述的血红蛋白缀合物，其中所述聚环氧烷
通过由亚烷基或亚苯基组成的接头键联至硫醇反应性部分。
18.如权利要求1-17中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述

\t血红蛋白是在所述血红蛋白分子的两个β82赖氨酸残基处双(2，5-二
溴水杨基)富马酸酯交联的。
19.如权利要求1-18中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中胶体
渗透压是至少75mmHg。
20.如权利要求1-19中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中P50
是约2至约4mmHg。
21.如权利要求20所述的血红蛋白缀合物，其中P50是约3
mmHg。
22.如权利要求1-21中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述
血红蛋白缀合物与氧配位。
23.如权利要求1-22中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述
血红蛋白缀合物与一氧化碳配位。
24.如权利要求1-23中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述
血红蛋白缀合物与氧化氮配位。
25.如权利要求1-24中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述
血红蛋白缀合物是脱氧的。
26.如权利要求1-25中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所述
PAO是聚乙二醇(PEG)。
27.如权利要求26所述的血红蛋白缀合物，其中所述PEG的平
均分子量是约2,000至约20,000道尔顿。
28.如权利要求26所述的血红蛋白缀合物，其中所述PEG的平
均分子量是约3,000至约10,000道尔顿。
29.如权利要求26所述的血红蛋白缀合物，其中所述PEG的平

\t均分子量是约4,000至约6,000道尔顿。
30.如权利要求29所述的血红蛋白缀合物，其中所述PEG的平
均分子量是约5,000道尔顿。
31.如权利要求26-30中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所
述PEG是马来酰亚胺-PEG。
32.如权利要求31所述的血红蛋白缀合物，其中所述马来酰亚
胺经由亚烷基或亚苯基接头键联至所述PEG。
33.如权利要求32所述的血红蛋白缀合物，其中所述亚烷基接
头是亚乙基接头。
34.如权利要求31-33中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所
述马来酰亚胺-PEG是缀合至所述血红蛋白的硫醇部分，所述硫醇部
分选自所述血红蛋白的半胱氨酸残基的固有硫醇部分、所述血红蛋白
的硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分或其组合。
35.如权利要求1-34中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中N-
乙基马来酰亚胺缀合至所述血红蛋白的β93半胱氨酸残基。
36.如权利要求31-34中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中所
述马来酰亚胺-PEG具有以下结构
其中：
Hb是血红蛋白，
S是所述血红蛋白的硫醇，
R3是亚烷基或亚苯基，
X是末端基团，
m是缀合至所述血红蛋白的马来酰亚胺基活化的PEG聚合物的
平均数目，并且
n是平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧化乙烯
单元的平均数目。
37.如权利要求36所述的血红蛋白缀合物，其中R3是亚乙基。
38.如权利要求36或37所述的血红蛋白缀合物，其中X是甲氧
基或羧基。
39.如权利要求38所述的血红蛋白缀合物，其中X是甲氧基。
40.如权利要求36-39中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中n
是约3,000至约10,000道尔顿。
41.如权利要求36-39中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中n
是4,000至约6,000道尔顿。
42.如权利要求36-39中任一项所述的血红蛋白缀合物，其中n
是约5,000道尔顿。...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·D·范德格里夫，A·马拉瓦尔立，S·D·奥尔森，
申请(专利权)人：桑加特公司，
类型：发明
国别省市：美国;US