包含高氧亲和力的修饰血红蛋白的氧气输送方法和组合物技术

本发明专利技术涉及血液制品，更特别涉及包含具有高氧亲和力的修饰氧合血红蛋白的组合物以及制备该组合物的方法。本发明专利技术的组合物具有较好的自身氧化稳定性以及优良的携氧特征。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

Oxygen delivery methods and compositions comprising modified hemoglobin with high oxygen affinity

The present invention relates to blood products, more particularly to compositions comprising modified oxy hemoglobin having high oxygen affinity and methods of making the same. The composition of the invention has good self oxidation stability and excellent oxygen carrying characteristics.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及血液制品，更特别涉及包含具有高氧亲和力的修饰血红蛋白的组合物以及制备该组合物的方法。
技术介绍
循环系统及血红蛋白特件血液是为组织输送营养并从组织中移去排泄废物的工具。血液由其中悬浮红细胞(RBC或红血球)、白细胞(WBC)和血小板的血浆组成。红细胞约占血液中的细胞的99%，其主要功能是为组织输送氧气并 从中移去二氧化碳。心脏的左心室泵送血液通过循环系统的动脉和较小的微动脉。血液然后进入毛细血管，从中进行营养和细胞废物的大部分交换。(参见例如A.C.Guyton, "Human PhysiologyAnd Mechanisms Of Disease"(第三版；W.B.Saunders C0., Philadelphia, Pa.), 228-229页(1982))。此后，血液经过微静脉和静脉而返回心脏的右心房。尽管返回心脏的血液较之从心脏泵出的血液氧气不足，但安静时，返回的血液仍包含约75%的初始氧含量。红细胞可逆的氧合功能(即输送氧气)是通过蛋白质血红蛋白实现的。哺乳动物血红蛋白的分子量约64，000道尔顿，由约6%血红素和94%珠蛋白组成。其天然形式包含两对亚基(即其为四聚体)，各自包含血红素基团和珠蛋白多肽链。血红蛋白在水溶液中处于四聚体(MW64，000)和二聚体(MW32，000)形式之间的平衡；红细胞外的二聚体由肾脏过早排出(血浆半衰期约2-4小时)。除血红蛋白外，RBC还包含基质(RBC膜)，其中包含蛋白质、胆固醇和磷脂。外源性血.液制品由于医院及其它环境下的血液制品需求，已经针对血液代用品(bloodsubstitute)和血浆扩容剂进行了广泛研究。血液代用品是能够携带并为组织供应氧气的血液制品。血液代用品具有多种用途，包括替代手术过程中和急性出血后的失血，以及创伤性损伤后的复苏过程。血浆扩容剂是输入血管系统、但一般不能携氧的血液代用品。血浆扩容剂可用于例如替代烧伤中的血浆损失、治疗容量不足性休克以及实现血液稀释(例如维持血量正常和降低血粘度)。基本上，血液代用品可用于所述目的或当前给予患者库存血液的任何目的。(参见例如Bonson等人美国专利4，001，401以及Morris等人专利4，061，736)。当前的人血液供给伴有若干局限性，可以通过使用外源性血液代用品而缓和。举例说明，安全有效的血液代用品的广泛利用将降低对库存(异体)血液的需要。此外，这种血液代用品允许在创伤性损伤后立即输注复苏液，而不考虑交叉配型(血液则需要)，从而节省了为缺血性组织再供给氧气的重要时间。而且，可以在手术前给予患者血液代用品，使得可以取出患者自体血液，如果需要，能够在该过程中稍后回输，或在手术后回输。因此，使用外源性血液制品不只保护患者免于接触非自体(异体)血液，也保存自体或异体(库存、交叉配型的)血液以供其最适用途。当前血液代用品的局限制备血液代用品(有时称作”携氧血浆扩容剂”)的努力迄今所制备的产品效果差强人意，或其生产费时、费钱或兼而有之。生产这些产品的费用常常很高，以致实际上妨碍了产品的广泛应用，尤其是在那些存在巨大需求的市场中(例如新出现的第三世界经济)。血液代用品可以分为以下三类:i)基于全氟化碳的乳剂，ii)脂质体包封血红蛋白，iii)修饰的无细胞血红蛋白。如下所述，尽管认为包含修饰的无细胞血红蛋白的产品最有希望，但均未完全成功。基于全氟化合物的组合物溶解氧气，而不与其结合为配基。为了用于生物系统，全氟碳化合物必须与脂类、一般为卵黄磷脂乳化。尽管全氟化碳乳剂制备便宜，但不能在临床耐受剂量下携带足够有效的氧气。相反，已经表明脂质体包封血红蛋白是有效的，但其广泛使用极为昂贵。(一般参见Winslow, Robert Μ., ^Hemoglobin-based RedCell Substitutes, ^Johns Hopkins University Press, Baltimore(1992))。当今临床试验的大部分血液代用品产品是基于修饰的血红蛋白。这些产品通常称作基于血红蛋白的氧载体(hemoglobin-based oxygen carriers, HBOC), 一般包含化学修饰血红蛋白的均一水溶液，基本不含其它红细胞残存(基质)。虽然人的无基质血红蛋白(stroma-free haemoglobin, SFH)是制备HBOC最常用的原材料,但也使用其它来源的血红蛋白。例如，血红蛋白可以得自或来源于动物血液(例如牛或猪血红蛋白)、或经分子改造为生产目的血红蛋白产品的细菌、或酵母、或转基因动物或植物。化学修饰一般为分子内交联、寡聚化和/或聚合物缀合之一，来修饰血红蛋白，使其在循环中的保留时间较之未修饰血红蛋白延长，其氧结合特性则与血液类似。分子内交联使四聚体血红蛋白单位的亚基化学结合在一起，以防止其形成如前所述过早排出的二聚体。(参见例如Rausch等人美国专利5，296，465)。制备HBOC产品的高额费用大大限制其商业生存力。此外，本专利技术人发现，已知的HBOC倾向于在微动脉壁而非毛细血管处向组织释放过量的氧气。这可导致HBOC对毛细血管周围的组织供氧不足。尽管HBOC最初的氧气载荷可能相对高于天然红细胞正常达到的量，极低亲和力的突变体除外。多数情况下，设计HBOC的氧亲和力等于或低于天然血红蛋白。但如上所述，这可能导致组织供氧不足。因此，本专利技术涉及包含在含水稀释剂中具有高氧亲和力的HBOC的血液代用品。专利技术概述本专利技术的方法和组合物可用于多种环境下，包括急诊室、手术室、军事冲突、肿瘤医院和兽医诊所。本专利技术的低毒性和高稳定性允许室温保存，而不损害所述血液代用品的效力。本专利技术还避开了血型的交叉配型以及相关的实验室检测要求，允许更早、更安全介入患者治疗。本专利技术的低毒性、长期稳定性以及通用性加在一起，因而表现为一种特别有用的血液代用品。一方面，本专利技术提供了包含表面修饰的氧合血红蛋白的血液代用品产品，其中在相同条件下检测时，该表面修饰的氧合血红蛋白的P50低于相同动物来源(即来自相同种类动物)的天然无基质血红蛋白。合适的动物来源包括，例如人、牛、猪、马。在一个优选实施方案中，该血液代用品产品采取包含表面修饰的氧合血红蛋白和含水稀释剂的组合物的形式。在一个特定实施方案中，该表面修饰的氧合血红蛋白的P50小于IOtorr,优选小于 7torr。另一方面，本专利技术提供了通过在氧合血红蛋白上共价连接一种或多种聚环氧烷(polyalkylene oxides)而生成的血液代用品产品。在一个特定实施方案中，该血液代用品产品通过共价连接聚环氧烷的聚合物而生成，例如具有化学式H(OCH2CH2)nOH的聚乙二醇(PEG)，其中η大于或等于4。优选该产品的闻铁血红蛋白/总血红蛋白之比小于0.10。另一方面，本专利技术提供了包含PEG-血红蛋白缀合物、在24° C对自身氧化稳定的血液代用品产品，其中高铁血红蛋白/总血红蛋白之比小于0.10，并且该PEG-血红蛋白缀合物的Ρ50小于lOtorr。另一方面，本专利技术提供了制备血液代用品组合物的方法，其包含以下步骤:a)制备高铁血红蛋白/总血红蛋白之比小于0.10的血红蛋白；b)在血红蛋白上共价连接聚环氧烷，形成P50小于IOtorr的表面修饰的氧合本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含修饰的血红蛋白和含水稀释剂的药学组合物，其中该修饰的血红蛋白是已经通过对于血红蛋白分子上的暴露的氨基酸侧链的巯基基团的巯基反应性部分共价连接聚环氧烷的血红蛋白，而同时该血红蛋白处于氧合状态；聚环氧烷通过选自亚烃基或亚胺基的接头连接至巯基反应性部分；以及其中在37°C,pH7.4测量时，该修饰的血红蛋白的P50低于15torr。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：R·M·温斯洛，K·D·万得格里夫，
申请(专利权)人：桑格特公司，
类型：发明
国别省市：