本发明专利技术公开了一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球的制备及其应用。该材料表面含有高密度的硼酸基团，能对富含顺式二羟基的生物分子产生多价协同结合，从而显著提高结合力。该材料对糖蛋白的解离常数为10-5～10-6M，与通常的硼酸功能化材料比较结合力提高了3-4个数量级，并且能富集浓度低至2×10-14M的糖蛋白。此外该材料还具有抗干扰能力强，结合容量高，结合/解析速度快等优点。由于该材料具有磁性，通过施加外磁场可以方便地对样品进行处理。本发明专利技术的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球可以便捷地对复杂样品中低丰度的富含顺式二羟基的生物分子进行富集、纯化和分离。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及功能化材料领域，也涉及顺式二羟基的生物分子的富集、纯化和分离。
技术介绍
顺式二羟基生物分子是含有顺式二羟基结构的一类化合物，如糖类，糖蛋白和糖肽，核苷和核苷酸，它们分别是糖组学、蛋白质组学及代谢组学等领域的主要研究对象。这些顺式二羟基生物分子具有很重要的研究价值，如糖类在生命活动过程中起着重要的作用，是一切生命体维持生命活动所需能量的主要来源。许多糖蛋白是临床上癌症的生物标志物及治疗的靶标，如甲胎蛋白、癌胚抗原、CA125以及前列腺特异性抗原等。但是糖蛋白在样本中的丰度非常低，并且往往伴随着高丰度的干扰组分。因此对其进行选择性富集，同时有效的去除高丰度干扰组分对这些糖蛋白的分析至关重要。取代硼酸是一类独特的配基，它和顺式二羟基结构在高pH值下共价结合形成环状酯，该酯可以在酸性条件下解离。这种PH开关的性质使取代硼酸成为一种重要的用于分离富集顺式二羟基化合物的配基。尽管取代硼酸已经显示了在选择性富集顺式二羟基化合物方面的应用前景，但亲和力弱这一致命缺陷却阻碍了其广泛的应用。大部分取代硼酸与顺式二羟基化合物的解离常数在KT1到1(Γ4之间[参见Tetrahedron2004, 60, 11205 -11209; Anal.Chem.2013, 85，2361 - 2369]，因此从本质上讲取代硼酸不能富集浓度很低的顺式二羟基化合物，而一些重要的糖蛋白和聚糖等通常在生物样品中丰度却很低。所以，高亲和力的硼酸功能化材料是至关重要的。类似树枝状硼酸功能化磁性微球及其制备和应用方面的材料目前尚未有文献和专利报道。
技术实现思路
为了克服现有取代硼酸及其功能化材料亲和力弱的缺点，本专利技术的第一目的在于提供一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球。本专利技术的第二目的在于提供一种便捷地制备高亲和力、高容量的树枝状硼酸功能化磁性微球的方法，本专利技术的第三目的在于提供上述高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球在各种复杂样品中的低丰度的糖蛋白和聚糖等的富集、纯化和分离等应用。为了解决上述目的，本专利技术的技术方案如下:一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，它是在磁性载体上引入树枝状高分子后经过硼酸功能化得到的树枝状硼酸功能化磁性材料。由于树枝状高分子含有大量的表面基团，经硼酸修饰后，材料表面含有高密度的硼酸基团，能对富含顺式二羟基的生物分子如糖蛋白等产生多价协同结合，从而显著提高结合力。所述磁性载体为磁性纳米粒子，或者磁性微米粒子。上述磁性纳米粒子为氨基功能化磁性纳米粒子、或者其他含有活性基团，如羧基功能化，巯基功能化，环氧基团功能化，羟基功能化以及醛基功能化的纳米粒子；所述磁性微米粒子为羧基功能化磁性微米粒子，或者其他含有活性基团，如氨基功能化，巯基功能化，环氧基团功能化，羟基功能化以及醛基功能化的磁性微米粒子。本专利技术中，所述树枝状高分子为聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状高分子，或者其他的的树枝状高分子。上述聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状高分子为其第四代至第七代中的任何一代。上述高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球的制备方法，该方法包括如下步骤:I)将树枝状高分子固载于磁性载体上:首先将磁性载体活化，然后将活化得到的磁性载体分散在树枝状高分子溶液中，室温下搅拌得到树枝状高分子修饰的磁性材料；2)对树枝状高分子修饰的磁性载体进行硼酸功能化:将步骤I)得到的树枝状高分子修饰的磁性材料分散在取代硼酸溶液中，室温下搅拌反应即得到所述树枝状硼酸功能化磁性微球。一种制备磁性纳米粒子的方法如下:步骤1)，氨基功能化磁性纳米粒子分散在适量戊二醛的无水甲醇中，室温下机械搅拌6-12小时，制得醛基活化的磁性纳米粒子；将所得的醛基活化的磁性纳米粒子分散在适量的聚酰胺-胺树枝状高分子和NaCNBH3的无水甲醇中，室温下机械搅拌12-24小时，得到树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子；步骤2)，将步骤I)得到的树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子分散在含有适量4-甲酰基苯硼酸以及NaCNBH3的无水甲醇溶液混合，室温下搅拌反应12-24小时即得到树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子。一种制备磁性微米粒子的方法如下:步骤I )，羧基功能化磁性微米粒子分散在2- (N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中，加入适量的1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，适量的聚酰胺-胺树枝状高分子，超声混合均匀，机械搅拌6-12个小时，即得树枝状高分子修饰的磁性微米粒子；步骤2)，将得到的树枝状高分子修饰的磁性微米粒子再次分散于2-(N_吗啉代)乙磺酸缓冲溶液，加入适量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，适量的4-羧基苯硼酸混合，室温下搅拌反应6-12小时即得到树枝状硼酸功能化的磁性微米粒子。本专利技术制备方法中，步骤2)中所用的取代硼酸可以是含有甲酰基、或羧基、或氨基活性基团的苯硼酸，或杂环硼酸。上述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球在富含顺式二羟基的生物分子中的富集、纯化和分离中的应用。尤其是在复杂样品体系中低丰度糖蛋白和聚糖等生物分子的应用。与通常的硼酸功能化材料相比，该材料对富含顺式二羟基的生物分子的结合能力显著增强。有益效果:与现有技术相比，本专利技术首次描述了一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球及其制备方法，该方法使硼酸对富含顺式二羟基的生物分子的亲和力显著提高。实验结果表明，由于树枝状高分子含有大量的表面基团，经硼酸修饰后，材料表面含有高密度的硼酸基团，能对富含顺式二羟基的生物分子产生多价协同结合，从而显著提高结合力。树枝状硼酸功能化材料弥补了硼酸亲和力弱的缺陷，使硼酸与糖蛋白的亲和力提高3-4个数量级，并且能富集浓度低至2X10_14M的糖蛋白；此外，该材料抗干扰能力强，能在1000倍的非糖蛋白的干扰下选择性富集糖蛋白，并且具有结合容量高和结合/解析速度快等优点。非常适合于低浓度糖蛋白和聚糖等顺式二羟基生物分子的选择性富集。附图说明图1为树枝状硼酸修饰磁性微球的结构示意图。图2为树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子的红外表征图，其中，a为氨基功能化磁性纳米粒子；b为树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子；c为树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子。图3为树枝状硼酸修饰磁性纳米粒子的热重表征图，其中，a为氨基功能化磁性纳米粒子；b为树枝状高分子修饰的磁性纳米粒子；c为树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子。图4树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子对糖蛋白的最低富集浓度。图5树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子在高浓度非糖蛋白的干扰下对糖蛋白的选择性富集，其中，a为lmg/mL糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)和lmg/mL非糖蛋白牛血清白蛋白(BSA)的混合物质谱谱图；b为树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子在I μ g/mL HRP和lmg/mLBSA (质量比1:1000)样品中的萃取物的质谱谱图6树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子对糖蛋白的萃取速度，其中，A)萃取时间；B)解析时间。图7树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子选择性富集唾液中的糖蛋白，其中，A)为唾液直接分析的质谱谱图；B)为树枝状硼酸功能化磁性纳米粒子在唾液中的萃取物的质谱谱图。具体实施方式实施例1:4-甲酰基苯硼酸功能化的树枝状硼酸修饰的磁性纳米粒子的制备(第四代PAMAM )200mg 氨基功能化磁性 Fe3O4 纳米粒子[参见 C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，它是在磁性载体表面引入树枝状高分子后再经硼酸功能化得到的树枝状硼酸功能化磁性微球。
【技术特征摘要】
1.一种高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，它是在磁性载体表面引入树枝状高分子后再经硼酸功能化得到的树枝状硼酸功能化磁性微球。2.根据权利要求1所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，所述磁性载体为磁性纳米粒子，或者磁性微米粒子。3.根据权利要求2所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，所述磁性纳米粒子为氨基功能化磁性纳米粒子或者其他含有活性基团的磁性纳米粒子；所述磁性微米粒子为羧基功能化磁性微米粒子或者其他含有活性基团的磁性纳米粒子。4.根据权利要求1所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，所述树枝状闻分子为聚酰胺_胺树枝状闻分子，或者其他的树枝状闻分子。5.根据权利要求4所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球，其特征在于，所述聚酰胺-胺树枝状高分子为其第四代至第七代中的任何一代。6.根据权利要求1所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: 1)将树枝状高分子固载于磁性载体上:首先将磁性载体活化，然后将活化得到的磁性载体分散在树枝状高分子溶液中，室温下搅拌得到树枝状高分子修饰的磁性材料； 2)对树枝状高分子修饰的磁性载体进行硼酸功能化:将步骤I)得到的树枝状高分子修饰的磁性材料分散在取 代硼酸溶液中，室温下搅拌反应即得到所述树枝状硼酸功能化磁性微球。7.根据权利要求6所述的高亲和力树枝状硼酸功能化磁性微球的制备方法，其特征在于，当磁性载体为磁性纳米粒子时的制备方法如下: 步骤I )，氨基功能化磁性纳米粒子分散在适量戊二醛的无...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘震，王合叶，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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