一种定点修饰N-末端的聚乙二醇化生长激素拮抗剂及其制备方法技术

技术编号:8677062 阅读:281 留言:0更新日期:2013-05-08 20:15
本发明专利技术涉及生物医药领域,具体地,本发明专利技术涉及一种定点修饰N-末端的聚乙二醇(PEG)化生长激素拮抗剂(GHA),以及其制备方法。所述方法包括以下:(1)以分子量为20kDa和40kDa的PEG醛分别定点修饰GHA的N末端;(2)用凝胶过滤色谱分离纯化上述两种PEG修饰产物;(3)两种PEG修饰产物的药效动力学的初步评价。其中,分子量为20kDa的PEG醛为优化的PEG,修饰产物具有较高的药效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域,具体地,本专利技术涉及一种定点修饰N-末端的聚乙二醇(PEG)化生长激素拮抗剂,以及其制备方法。
技术介绍
生长激素的主要作用在于促进生长,涉及调节身体的生长,以及调节蛋白质、碳水化合物和脂类的代谢。生长激素的代谢作用由胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)介导。垂体生长激素腺瘤是常见的垂体肿瘤之一,由于生长激素(GH)过度分泌、IGF-1浓度增高,导致巨人症和肢端肥大症,其病亡率可高达20%-30%。目前的治疗方法主要是减少或抑制生长激素的分泌,以降低生长激素的水平,防止生长激素的过度分泌,但是治疗效果不佳。生长激素拮抗剂(GHA)可通过阻止生长激素与其受体(GHR)的结合,阻止后续的信号转导,降低血浆IGF-1的水平,从而达到治疗的目的。GHA是通过置换人生长激素(hGH)的8个氨基酸残基,并用基因工程的方法表达出来的一种蛋白质。这8个氨基酸残基在人生长激素第I结合位点内,对生长激素与GHR的结合功能特别重要。其中,第18位天冬氨酸取代组氨酸(H18D)、第21位天冬酰胺取代组氨酸(H21N)、第167位天冬酰胺取代精氨酸(R167N)、第168位丙氨酸取代赖氨酸(K168A)、第171位丝氨酸取代天冬氨酸(D171S)、第172位精氨酸取代赖氨酸(K172R)、第174位丝氨酸取代谷氨酸(E174S)和第179位苏氨酸取代异亮氨酸(I179T)。通过 氨基酸的置换,使第I结合位点与GHR的亲和力大为增加。此外,B2036是一种人生长激素的9个氨基酸残基被置换的蛋白质。除了置换上述8个氨基酸残基以外,还有第I结合位点的第120位甘氨酸取代赖氨酸(G120K)。然而,B2036分子与GHR 二聚体的亲和力却与人生长激素相当。这是由于尽管B2036的第I结合位点与GHR的亲和力有所增加,但第2结合位点几乎失去了与GHR的结合能力,从而能够抑制生长激素的生物学功能。由于B2036在体内的血浆半衰期短,仅为15-20分钟,所以不能持续阻断生长激素的功能。在临床使用时需要加大给药量和给药次数,并带来一定的毒副作用,增加了病人的痛苦与经济负担。聚乙二醇(PEG)修饰被认为是一种能有效克服蛋白质药物血浆半衰期短的方法之一。这是因为PEG自身有着巨大的优势,它是一种线性的、在溶液中可自由卷曲且不带电荷的聚合物,具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性,已被美国FDA批准用于人体。目前已有多种PEG修饰的蛋白质药物被美国FDA批准上市,如PEG修饰的干扰素a 2a(Pegasys, Roche公司)等。使用PEG共价修饰蛋白质,可以延长蛋白质的体内循环半衰期,降低蛋白质的免疫原性,增加蛋白质的溶解性以及改变蛋白质在人体内的生物学分布。PEG修饰蛋白质和多肽主要是氨基修饰(包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、N端氨基的烷基化修饰)、羧基修饰以及巯基修饰等。其中,定点修饰主要包括N-末端修饰和半胱氨酸残基修饰。N-末端修饰是通过PEG醛与一定量的还原剂如氰基硼氢化钠(NaCNBH3)在偏酸的环境下进行的还原烷基化反应。Kopchick 等(Endocr.Rev.2002,23:623-646)将 B2036 分子共价修饰上 4 6个分子量为5kDa的PEG分子,得到的生长激素类似物称为PEG-B2036,即培维索孟(Pegvisomant)。由于Pegvisomant第168位和172位都不是赖氨酸残基,所以PEG化对Pegvisomant的第I结合位点的影响小于PEG_hGH(G120K)。而Pegvisomant第120位为赖氨酸残基,可被PEG化,进一步降低了它与第2结合位点的亲和力。Pegvisomant于2003年获得美国FDA的批准上市,用于治疗垂体生长激素腺瘤引起的肢端肥大症,商品名索马沃(Somavert)0目前,欧洲也已将其用于肢端肥大症的临床治疗。但是,由于Pegvisomant是在B2036分子上接上4飞个分子量为5kDa的PEG分子。这种修饰产物不均一,修饰位点随机性强,每种成分无法定量、也无法进行分离,使得批次间的重复性较差,不同批次间的产物生物活性或有差别,不利于产品的质量控制和临床应用。Ross等(J.Clin.Endocrinol.Metab.2001, 86:1716-1723)的研究也表明Pegvisomant与GHR 二聚体的亲和力要低于人生长激素。Pegvisomant与GHR 二聚体的亲和力为PEG-hGH (G120K)的6.6倍,但只有人生长激素的1/40。因此,Pegvisomant的浓度要远高于人生长激素才能达到拮抗的目的。这可能是因为在B2036分子的8个赖氨酸残基及N-末端残基上修饰4 6个5kDa的PEG分子后,降低了 Pegvisomant第I结合位点与GHR的亲和力。
技术实现思路
针对上述问题,本专利技术提出了一种PEG修饰GHA的方法。分别采用分子量为20kDa和40kDa的PEG醛定点修饰GHA的N-末端的α -氨基,制备分子量均一的定点修饰N-末端的PEG化GHA,即每个GHA分子的N-末端结合I个PEG分子。最终修饰产物成分单一,易于分离纯化,产物收率高,预期能减少GHA生物活性的损失。本专利技术的另一个目的还在于解决PEG修饰后GHA的半衰期增加而其药效降低的问题。通过比较分子量为20kDa和40kDa的PEG修饰产物对血浆IGF-1的抑制作用,探讨不同链长PEG对GHA生物活性的影响,寻找PEG修饰GHA的药代动力学与药效动力学间的平衡点。在实施方案中发现,20kDa的PEG修饰 产物(M-P20K-GHA)表现出较高的药效,而40kDa的PEG修饰产物(M-P40K-GHA)的药效几乎消失。因此,20kDa的PEG醛为优选的PEG用于修饰GHA。本专利技术制备N-末端PEG单修饰的生长激素拮抗剂的方法,包括以下步骤:(I)确定M-P20K-GHA的制备条件:将GHA置换到50mM NaAc-HAc缓冲液(ρΗ5.5)中。调整GHA浓度为2.2mg/mL (0.1mM),按GHA:PEG醛(20kDa)=NaCNBH3的不同摩尔比例,于4°C分别反应过夜Γ16小时)。以Superdex200凝胶过滤柱(IcmX 30cm)检测PEG修饰产物,洗脱液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。(2)修饰产物M-P20K-GHA的纯化及鉴定:根据步骤I所述,选择GHA:PEG醛(20kDa) =NaCNBH3 摩尔比 1:8:80 用于制备 M-P20K-GHA。以 Superdex200 凝胶过滤柱(1.6cmX60cm)对修饰产物进行分离纯化,洗脱液为20mM磷酸缓冲液(pH7.2)。收集修饰产物的洗脱峰,浓缩后用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱对修饰产物进行鉴定。(3)确定M-P40K-GHA的制备条件:将GHA置换到50mM NaAc-HAc缓冲液(ρΗ5.5)中。调整GHA浓度为2.2mg/mL (0.1mM),按GHA:PEG醛(40kDa):NaCNBH3的不同摩尔比例,于4°C分别反应过夜Γ16小时)。以Superdex200凝胶过滤柱(IcmX 30cm)检测PEG修饰产物,洗脱液为20mM磷酸缓冲液(pH7.本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种定点修饰N?末端的聚乙二醇(PEG)化生长激素拮抗剂(GHA),其特征在于PEG化生长激素拮抗剂是由PEG共价修饰到生长激素拮抗剂的N?末端。

【技术特征摘要】
1.一种定点修饰N-末端的聚乙二醇(PEG)化生长激素拮抗剂(GHA),其特征在于PEG化生长激素拮抗剂是由PEG共价修饰到生长激素拮抗剂的N-末端。2.根据权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂,其特征在于每个生长激素拮抗剂分子仅结合I个PEG分子。3.根据权利要求1所述的PEG化生长激素拮抗剂,其中PEG是单甲氧基聚乙二醇(mPEG),包括单甲氧基聚乙二醇醛、单甲氧基聚乙二醇醛琥珀酸基琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇醛琥珀酸基碳酸酯,其分子量在5kDa 40kDa之间。4.根据权利要求3所述的PEG化生长激素拮抗剂,所述mPEG分子量是20kDa,所述的mPEG是单甲氧基聚乙二醇醛,结构为mPEG-R-CHO,其中R是碳数为1_10的烷基。5.根据权利要求4所述的PEG化生长激素拮抗剂,所述单甲氧基聚乙二醇醛是单甲氧基聚乙二醇丙醛。6.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员:胡涛吴玲苏志国马光辉
申请(专利权)人:中国科学院过程工程研究所
类型:发明
国别省市:

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