本发明专利技术公开了一种光激发蛋白质中二硫键还原得到自由巯基的方法，该方法包括如下步骤：（1）配制蛋白质溶液，其蛋白质的浓度小于1mM，pH为7-8，蛋白质溶液的温度为10-400C；（2）用紫外光照射蛋白质溶液，其辐射的强度小于30W/m2，光照时间10-1000分钟，得到含有自由巯基的蛋白质。该方法操作简单，高效便捷，具有很强的特异性，而且对蛋白质的结构破坏最小。因此光激发蛋白质得到自由巯基的方法可以用于蛋白质在界面的高覆盖率，取向有序、特异性固定，这一技术在生物传感器、生物材料以及生物能源等领域具有重大的应用前景，将会给医疗、化工等行业发展带来巨大的经济效益和社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，主要用于生物材料、生物传感器中蛋白质的固定以及自组装。
技术介绍
在生物材料、生物传感器以及生物燃料电池等应用中都涉及到蛋白质在界面的吸附固定。为了提高蛋白质在界面的取向分布，更好的发挥其生物功能，人们需要对蛋白质进行修饰，加工。通常的办法是引入氨基、羧基以及巯基等活性基团，通过共价作用将载体蛋白质固定在界面上，实现生物分子固定化的专一性和分子取向的有序性，直接决定了生物传感器的灵敏性和生物材料的特异性[Rusmini F，et al., Biomacromolecules 2007, 8,1775-1789，Hernandez K，et al., Enzyme and Microbial Technology 2011，48，107 -122]。其中巯基是最常用的一类活性基团，硫原子非常活跃，和很多金属GnAiuAg和Pt)以及各种含硫分子具有很强的相互作用，可在界面形成高度有序且密集排列的生物功能膜，而且分子另一端可以带上不同的活性功能团以适用不同的性能需求[Kawada J, et al.，Biomacromolecules 2005，6，2271-2274，Rezwanj K，et al.，Langmuir 2005，21，3493-3497]。目前在蛋白质中引入自由巯基的方法，主要有定点突变引入半胱氨酸，利用DTT等进行二硫键还原以及利用巯基特异性试剂如马来酰亚胺等进行衍生[Johnson S，etal., Anal.Chem.2008, 80, 978-983，Gauvreau V, et al., Bioconjugate Chemistry2004, 15, 1146-1156，Jongsma MA, et al., Proteomics 2006, 6, 2650-2655，Lud SQ,et al., Langmuir 2010, 26，15895 - 15900]。这些方法步骤比较繁琐，对温度、pH等溶剂环境要求比较高，同时可能降低或者破坏蛋白质的结构和活性，而且修饰后的蛋白质的制备和纯化过程耗时比较长，耗材比较贵，从而限制了蛋白质在生物传感器以及生物材料中的应用。半胱氨酸、色氨 酸、络氨酸是天然的氨基酸，是蛋白质序列结构的重要组成部分。其中两个半胱氨酸形成二硫键对蛋白质的构象稳定以及生物活性具有重要的作用。色氨酸和络氨酸等芳香氨基酸是蛋白质中重要的吸光氨基酸，受到紫外光的照射，可以发出荧光，是观测蛋白质结构变化的重要探针。通过对大量蛋白质的序列结构比对以及实验验证，我们发现在大量蛋白质家族中，都存在芳香氨基酸和二硫键临近的空间构象。这一保守的结构模式存在于溶菌酶、角质酶、乳白蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白、胰岛素以及水解酶、脂肪酶和喊性憐酸酶等蛋白家族[Serrano AL, et al., Protein Science 2012, 21, 157-170,Prompers JJj et al.，FEBS Letter 1999，456，409-416，Wu LZj et al.，J MolStruct 2008， 882， 101-106]。
技术实现思路
技术问题:本专利技术的目的是提出一种光激发蛋白质得到自由巯基的方法，具有反应快速，操作简单，高效稳定的特点，可以用于生物传感器和生物材料中蛋白质的特异性固定。本专利技术的技术方案为:，其特征在于该方法包括如下步骤: (O配制蛋白质溶液，其蛋白质的浓度小于I mM，PH为7-8，蛋白质溶液的温度为10-40 0C ； (2)用紫外光照射蛋白质溶液，其辐射的强度小于30W/m2，光照时间10-1000分钟，得到含有自由疏基的蛋白质。所述的紫外光波段为260_300nm，由高压汞灯、氢灯或氙灯提供。所述的蛋白质为具有芳香氣基酸与_■硫键空间临近构象的蛋白质，蛋白质中的芳香基氨基酸和组成硫键的半胱氨酸的原子间距离小于ιοΑ。所述蛋白质为溶菌酶、角质酶、乳白蛋白、免疫球蛋白、水解酶、脂肪酶或碱性磷酸酶。芳香基氨基酸为色氨酸或络氨酸吸收光子能量，传递给临近的半胱氨酸，导致二硫键还原。，生成的自由巯基可以用于蛋白质的固定。本专利技术的机理:首先配置一定浓度的蛋白质溶液，在紫外辐射过程中，芳香氨基酸吸收了光子，跃迁到激发态，和临近的二硫键之间存在能量和电子转移，长期的紫外辐射能导致二硫键的还原，从而得到含有自由巯基的蛋白质，自由的巯基可以用于蛋白质在纳米颗粒、电极，衬底等界面的定向固定。本专利技术具有以下优点:1、利用蛋白质自身的结构特点，通过紫外光的吸收对二硫键还原，同蛋白质定点突变和巯基衍生方法相比，步骤简单，反应快速，节省了时间和耗材；2、根据蛋白质中二硫键和芳香氨基酸的分布，通过改变辐射的强度、温度以及时间，可以选择性的打开二硫键，实现局域的氧化还原，控制生成的自由巯基的数目；3、紫外辐射导致二硫键还原，瞬时高效，同定点突变和化学衍生法相比，对蛋白质的结构和活性影响最小；4、光照辐射蛋白质产生自由巯基，同定点突变和化学衍生法相比，对溶剂环境要求比较低，可以在较宽范围的温度，PH，离子浓度的溶剂环境中进行；5、光照辐射蛋白质产生自由巯基，方法简单，操作便捷，可以同步实现多种蛋白质的二硫键还原，便于生物芯片等大量蛋白质的特异性固定；6、操作简单，高效便捷，只需要控制紫外光的强度和辐射时间，就可以激发蛋白质中芳香氨基酸附近的二硫键断裂，具有很强的特异性，而且对蛋白质的结构破坏最小。因此光激发蛋白质得到自由巯基的方法可以用于蛋白质在界面的高覆盖率，取向有序、特异性固定，这一技术在生物传感器、生物材料以及生物能源等领域具有重大的应用前景，将会给医疗、化工等行业发展带来巨大的经济效益和社会效益。附图说明图1是紫外辐射蛋白质，色氨酸吸收能量导致临近的二硫键还原的示意图。 图2是实施例1中角质酶受光照后，测得荧光信号图和生成的自由巯基和DTNB反应的紫外吸收图；其中(a)是实施例1中角质酶经光照后，测得荧光信号图。角质酶在天然状态下荧光信号很弱，经光照后，荧光信号由弱变强。图2(b)是实施例1中角质酶受光照后，生成的自由巯基和DTNB反应的紫外吸收图。角质酶受光照辐射后，通过埃尔曼的试剂检测生成的自由巯基，一旦生成自由巯基，将和DTNB反应生成TNB—，TNB—在412nm有光谱吸收。图3是实施例2中溶菌酶受光照后，生成的自由巯基和DTNB反应的紫外吸收图。溶菌酶受光照辐射后，通过埃尔曼的试剂检测生成的自由巯基，一旦生成自由巯基，将和DTNB反应生成TNB' TNB-在412nm有光谱吸收。图4是免疫球蛋白G的”Y”型结构以及光照辐射后生成自由巯基和金纳米颗粒结合的示意图。具体实施例方式本专利技术利用紫外光照射蛋白质得到自由巯基的原理如图1所示，主要是芳香氨基酸如色氨酸吸光，能量传递给临近的二硫键，导致二硫键还原，生成自由巯基。本专利技术得到自由巯基的方法，按照下面步骤操作:首先选取蛋白质，通过蛋白质PDB数据库得到蛋白质的三维结构，确定蛋白质是否具有二硫键和芳香氨基酸临近的空间构象，如果芳香氨基酸和组成硫键的半胱氨酸的原子间距离小于10A，则二者具有临近的空间构象。其次配置一定浓度的蛋白质溶液，蛋白质浓度小于ImM, pH为7-8,将样品放入本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种光激发蛋白质中二硫键还原得到自由巯基的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：（1）配制蛋白质溶液，其蛋白质的浓度小于1?mM，pH为7?8，蛋白质溶液的温度为10?40℃；（2）用紫外光照射蛋白质溶液，其辐射的强度小于30W/m2，光照时间10?1000分钟，得到含有自由巯基的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种光激发蛋白质中二硫键还原得到自由巯基的方法，其特征在于该方法包括如下步骤: (O配制蛋白质溶液，其蛋白质的浓度小于1 mM，PH为7-8，蛋白质溶液的温度为10-40 0C ； (2)用紫外光照射蛋白质溶液，其辐射的强度小于30W/m2，光照时间10-1000分钟，得到含有自由疏基的蛋白质。2.根据权利要求1的一种光激发蛋白质中二硫键还原得到自由巯基的方法，其特征在于:所述的紫外光波段为260-300nm，由高压汞灯、氢灯或氙灯提供。3...
【专利技术属性】
技术研发人员：武灵芝，胡栋，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：
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