本发明专利技术涉及一种Ｔ＋１断裂蛋白质内含子的构建方法，包括：（１）利用两条ＰＣＲ引物对目的基因进行扩增；（２）将上述ＰＣＲ产物自连转化感受态细胞后得到的质粒经限制性内切酶双酶切，回收小片段；（３）利用限制性内切酶双酶切ｐＭＢＴ－０质粒，并回收大片段，然后与上述小片段进行连接转化，得到ｐＭＳｎｆ－Ｓ质粒。本发明专利技术简单，转换成Ｃ＋１型或Ｓ＋１型ｓｐｌｉｔ?ｉｎｔｅｉｎ后它仍具有剪接能力，具有较高通用性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属T+1断裂蛋白质内含子的构建领域，特别是涉及一种T+1断裂蛋白质内 含子的构建方法。
技术介绍
蛋白质含子(intein)是前体蛋白质(precursorprotein)中的一段插入序列。 蛋白质内含子两侧的氨基酸序列被称为蛋白质外显子(extein)。在前体蛋白质的翻译 后成熟过程中蛋白质内含子从前体蛋白质中自我切除，两侧的蛋白质外显子以天然肽键 连接，这一成熟过程被称为蛋白质内含子介导的蛋白质剪接(intein-mediated protein splicing) 0常见蛋白质内含子按照其结构特征分为三类标准蛋白质内含子(canonical intein)，微小蛋白质内含子(mini-intein)和断裂蛋白质内含子(split intein) 0其中 标准蛋白质内含子(canonical intein)由N端剪接区域、中部归巢核酸内切酶区域和C端 剪接区域组成。N端剪接区域和C端剪接区域形成蛋白质剪接结构域，参与蛋白质剪接过 程；中部归巢核酸内切酶区域独自形成归巢核酸内切酶结构域，参与蛋白质内含子的归巢 过程。某些intein在进化过程中丢失或运用人工手段移去核酸内切酶结构域，由长度不等 的linker连接两端的剪接结构域，成为微小蛋白质内含子(mini-intein)。典型的蛋白质 内含子元件含有A，B，F和G四个保守的蛋白质剪接模块归巢核酸内切酶的序列位于模块B 和F之间。而绝大部分天然或人工型断裂蛋白质内含子在模块B和F之间断裂，编码序列 位于两个阅读框架中，产生C端蛋白质内含子片段(I。)和N端蛋白质内含子片段(IN)。翻 译后的两部分序列能够相互识别，进行反式剪接(trans-splicing)。split intein的这一 特性已被成功应用于蛋白质研究中，例如蛋白质的自身环化、作为标签辅助蛋白质纯化、蛋 白质特异位点的修饰、基因治疗以及蛋白与蛋白之间的相互作用和细胞定位等研究。蛋白质内含子的分子机制包括剪接位点的N-S(N-O)酰基转化，分支中间物的形 成，天冬酰胺残基的环化和自发的S-N(O-N)的酰基重排四步反应。C端外显子(C-extein) 的第一个氨基酸残基较为保守，一般为Cys/Ser/Thr，普遍认为该氨基酸在蛋白内含子自我 剪接反应中意义重大，它所发动的亲核进攻使N端内含子与外显子间发生断裂，由此推进 剪接反应的进程。因此按C-extein首位氨基酸种类将蛋白质内含子划分为Cys+1 (C+1)、 Ser+1 (S+1)和Thr+1 (T+1)型三类。然而应用于研究中的蛋白质内含子均为C+1和S+1型， 它们仅在Cys和Ser前插入后行使功能，而在Thr前面插入时丧失原有剪接活性。这无疑 限制了 intein在蛋白质研究领域的应用范围，获得一类对C-extein首位氨基酸通用性高 的split intein对其得到广泛应用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种T+1断裂蛋白质内含子的构建方法，方法 简单，转换成c+1型或S+1型split intein后它仍具有剪接能力，具有较高通用性。本专利技术的一种T+1断裂蛋白质内含子的构建方法，包括3(1)利用两条PCR引物对目的基因进行扩增；引物序列上游引物为 5，-AAGTTAATCAACCATGGTGATGATGGTGATGACC-3，，下游引物 为 5' -AAGGAGGAAAAACATATGGGCAGTGGATCCGGTCTGCAA-3'；或引物序列上游引物为5，-AAGTTAATCAATTAACATAAATTTCTGTATCGTG-3，，下游引 物为 5’ -AAGGAGGAAAAACATATGGGTATGGTAATGGAAGCAGAA-3'；(2)将上述PCR产物自连转化感受态细胞后得到的质粒经限制性内切酶双酶切， 回收600-700bp小片段；(3)利用限制性内切酶双酶切PMBT-O质粒，并回收6000-7000片段，然后与上述小 片段进行连接转化，得到pMSnf-S质粒。所述步骤⑴使用的模板为pUCSnf-m 在NCBI的intein数据库中获得 Ter Snf2的序列，通过基因合成方法去除124_424bp的长度为199bp的序列并替换为 Iinker(ASGHHHHHHHGGSGSG)即为 Snf-m(mini-intein)，将其装在上下游含有 XhoI 和 AgeI 两酶切位点的PUC 57载体中。所述步骤(2)或(3)中的限制性内切酶为XhoI ^P AgeLXhoI和AgeI的摩尔比为 2 I0所述步骤(2)中所使用的PCR方法为Inverse PCR(反应程序:94°C,3min ；95°C, 30s, 54°C，30s, 72°C，80s, 30 个循环；72°C，5min)。所述步骤(3)中所使用的pMBT-Ο质粒在NCBI的intein数据库中获得Ter DnaB-I的序列，通过基因合成方法将其装在上下游含有XhoI和AgeI两酶切位点的载体中， 属pMAL载体。本专利技术利用XhoI和AgeI双酶切鉴定pMSnf-S质粒，运用western blot检测 pMSnf-S在Ε. coli体内的剪接活性。利用本专利技术的方法可以将蛋白质内含子在任意处断 开，并对活动活性更高的应用型Τ+1蛋白质内含子提供方法。本专利技术对来源于真细菌藻青菌(Cyanobacterium)所编码的SNF2/Rad54解旋酶基 因中的Ter Snf2 intein展开研究。将其人工断裂改造并克隆于pMST表达载体中，获得 首个具有剪接活性的两类T+1型断裂蛋白质内含子，其介导的蛋白反式剪接效率分别达到 53. 5%和33. 3%。采用特定碱基取代法研究intein插入位点的适应性，以及对剪接效率的 影响，研究结果表明将其转换成C+1型或S+1型split intein后它仍具有剪接能力，具有 较高通用性。其具体实验流程如图1所示。通过序列比对，人工构建的方法，实现从天然C端外显子为苏氨酸(Thr)的标准蛋 白质内含子(Ter Snf2)构建出一类T+1型断裂蛋白质内含子，为蛋白质反式剪接技术在 蛋白质工程领域广泛应用提供了契机。截止到2010年7月InBase Intein DateBase中 共收录Intein数目约为600个，据统计T+1型、C+1型和S+1型intein的数目比例约为 2:5:5。含巯基氨基酸Cys在蛋白质中出现的频率较低，这使得C+1型intein的应用 价值并不显著，然而Thr的出现率较高，因此获得在Thr前发生高效剪接的断裂intein必 然会有较好的应用前景。有益效果本专利技术的方法简单，转换成C+1型或S+1型split intein后它仍具有剪接能力， 具有较高通用性。附图说明图1T+1断裂蛋白质内含子的构建示意图；M 麦芽糖结合蛋白，T 硫氧还蛋白， TGA 终止密码子，ATG 起始密码子，In Snf-SO或Snf-Sl的N端，Ic Snf-SO或Snf-Sl的 C端；图2inVerSePCR琼脂糖凝胶电泳图；图3pMSnf-S0和pMSnf-Sl利用XhoI和AgeI双酶切后琼脂糖凝胶电泳验证图；图4western blot检测pMSnf-SO本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
一种T+1断裂蛋白质内含子的构建方法，包括(1)利用两条PCR引物对目的基因进行扩增；引物序列上游引物为5’ AAGTTAATCAACCATGGTGATGATGGTGATGACC 3’，下游引物为5’ AAGGAGGAAAAACATATGGGCAGTGGATCCGGTCTGCAA 3’；或引物序列上游引物为5’ AAGTTAATCAATTAACATAAATTTCTGTATCGTG 3’，下游引物为5’ AAGGAGGAAAAACATATGGGTATGGTAATGGAAGCAGAA 3’；(2)将上述PCR产物自连转化感受态细胞后得到的质粒经限制性内切酶双酶切，回收600 700...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟清，王瑾，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31
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