本发明专利技术涉及增强表达的内含子序列，用于鉴定并使用具有增强基因表达特性的内含子的方法。根据本发明专利技术教导能够鉴定引起内含子介导性基因表达增强(IME)的内含子。本发明专利技术还涉及包含与启动子序列和核酸序列有效连接的所述IME内含子的重组表达构建体和重组表达载体。本发明专利技术还涉及用这些重组表达构建体或载体所转化的转基因植物或转基因植物细胞，涉及从其衍生的培养物、部分或繁殖材料，并涉及它们用于制备食品、动物饲料、种子、药物或精细化学品的用途，涉及改善植物生物量，产量或提供需要的表型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于鉴定并使用具有增强基因表达特性的内含子的方法。根据本专利技术教导能够鉴定引起内含子介导性基因表达增强(ME)的内含子。本专利技术还涉及包含与启动子序列和核酸序列有效连接的所述IME内含子的重组表达构建体和重组表达载体。本专利技术还涉及用这些重组表达构建体或载体所转化的转基因植物或转基因植物细胞，涉及从其衍生的培养物、部分或繁殖材料，并涉及它们用于制备食品、动物饲料、种子、药物或精细化学品的用途，涉及改善植物生物量、产量或提供需要的表型。专利技术背景 植物生物技术的目标是产生具备有利的新特性如抗虫性和抗病性、环境胁迫(例如干旱)抗性、改善的品质(例如高产量)或用于产生某些化学品或药物的植物。适宜的基因表达速率在得到所需要的表型中发挥重要作用。基因表达速率主要受到特定基因的启动子、位于5'非转录区和5'非翻译区内的额外DNA序列及终止子序列的调节。启动子是位于基因5'末端的部分DNA序列，其含有RNA聚合酶启动转录以至于蛋白质合成随后可以继续进行的信号。位于5'非转录区内的调节性DNA序列调节应答特定生物性刺激(例如病原体感染)或非生物刺激(例如盐胁迫、热胁迫、干旱胁迫)的基因表达。此外，已经鉴定了以不依赖位置和方向的方式提高位于附近基因的表达水平的其它所谓“增强子”序列。除了位于基因非转录区内的元件(例如启动子、增强子)以外，已报道了类型广泛的生物(例如线虫(nematode)、昆虫、哺乳动物和植物)中的一些内含子具有增强基因表达的特性。在植物中，相对于缺少内含子的构建体而言，在基因构建体内包含一些内含子导致增加mRNA和蛋白质累积。这种效应已被称作基因表达的“内含子介导性增强”(ME)(Mascarenhas 等(1990)Plant Mol. Biol. 15 :913_920)。已知在植物中刺激表达的内含子已经在玉米基因(例如 tubAl、Adhl、Shi、Ubil )和在稻基因内(例如salT、tpi )中得到鉴定。类似地，已经发现来自双子叶植物基因的内含子，如来自碧冬茄(petunia)(例如 rbcS)、马铃薯(例如 st-lsl)和来自拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)(例如ubq3和patl)的那些内含子提高基因表达速率(Dean等(1989)Plant Celll 201-208 ;Leon 等(1991)Plant Phyisiol. 95 :968_972 ;Norris 等(1993)Plant Mol Biol21:895-906 ;Rose 和 Last (1997)Plant J 11:455-464)。已经证实在内含子剪接位点内的缺失或突变降低基因表达，表明剪接作用可能是頂E所需要的(Mascarenhas等(1990)Plant Mol Biol 15 :913_920 ;Clancy 和 Hannah (2002) Plant Physiol 130:918-929)。然而，已经通过在来自拟南芥菜的patl基因剪接位点内点突变证实对于双子叶植物中的某些頂E，并不需要剪接作用本身(Rose 和 Beliakoff (2000)Plant Physiol 122:535-542)。通过内含子增强基因的表达不是普遍现象，因为向重组表达盒插入一些内含子未能增强表达(例如来自双子叶植物基因的内含子(来自豌豆的rbcS基因、来自菜豆(bean)的菜豆蛋白基因和来自马铃薯(Solanumtuberosum)的stls_l基因)和来自玉米基因的内含子(adhl基因第九内含子、hsp81基因第一内含子))(Chee等(1986)Gene41 :47_57 ；Kuhlemeier 等(1988)Mol Gen Genet 212 :405_411 ；Mascarenhas 等(1990)Plant MolBioll5 :913_920 ;Sinibaldi和Mettler (1992)在WE Cohn,K Moldave编辑的《Progress inNucleic Acid Research and Molecular Biology》第 42 卷，Academic Press, New York,第 229-257 页；Vancanneyt 等 1990 Mol GenGent 220:245-250)。因此，并非可以采用每一内含子以便在转基因植物中操纵外源基因或内源基因的基因表达水平。内含子序列内必须存在何种特征性或特异性序列特点以增强给定基因表达在现有技术内是未知的，并且从现有技术不可能预测给定的植物内含子在异源使用时是否将引起IME。将外来基因导入新的植物宿主并不总是导致引进基因高表达。此外，若处理复杂 性状，有时候需要以时间差异表达方式或空间差异表达方式调节数个基因。内含子原则上可提供如此调节。然而，相同内含子在一种植物中的多重使用已经显示出表现不利之处。在这些情况下，需要拥有用于构建适宜的重组DNA元件的基础控制元件集合。然而，可获得的具有增强表达特性的内含子集合是有限的并且需要替代物。因此，对包括启动子、调节序列(例如诱导元件、增强子)或内含子序列在内的影响基因表达速率的基本控制元件的需要仍持续增长。本专利技术的目的因此是提供用于鉴定具有增强表达特性的内含子的高度可重复和可靠的方法。该目标通过本专利技术中提供的方法得到实现。专利技术简述本专利技术的第一主题物因而涉及用于鉴定具有在植物中增强表达特性的内含子的方法，包括从植物基因组中选择内含子，其中所述的内含子具有至少如下特征I)内含子长度短于1，000碱基对，并且II)存在包含二核苷酸序列5' -GT-3' (SEQ ID NO :78)的5'剪接位点，并且III)存在包含三核苷酸序列5' -CAG-3' (SEQ ID NO :79)的3'剪接位点，并且IV)在3'剪接位点上游存在类似于共有序列5' -CURAY-3' (SEQ IDNO :75)的分支点，并且V)从5'剪接位点向下游100个核苷酸范围至少40%的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量，并且VI)从3'剪接位点向上游100个核苷酸范围至少50%的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量，并且VII)整个内含子范围至少50%的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量和至少30%的胸腺嘧啶含量。在另一实施方案中，本专利技术涉及用于在植物内含子群体中富集具有在植物中增强表达特性的内含子数目至所述群体的至少50%的方法，该方法包括从所述群体内选择内含子，其中该内含子具有至少如下特征I)内含子长度短于1，000碱基对，并且II)存在包含二核苷酸序列5' -GT-3' (SEQ ID NO :78)的5'剪接位点，并且III)存在包含三核苷酸序列5' -CAG-3' (SEQ ID NO :79)的3'剪接位点，并且IV)在3'剪接位点上游存在类似于共有序列5' -CURAY-3' (SEQ IDNO :75)的分支点，并且V)从5'剪接位点向下游100个核苷酸范围至少40%的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量，并且VI)从3'剪接位点向上游100个核苷酸范围至少50%的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量，并且VII)整个内含子范围至少50%的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量和至少30%的胸腺嘧啶 含量。优选地，选择用于富集具有在植物中增强基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组DNA表达构建体，包含：a)至少一个在植物或植物细胞中有功能的启动子序列，和b)选自SEQ？ID？NO：1、2、3、5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22所描述序列的至少一个内含子及其功能性等效物，和c)至少一个核酸序列，其中至少一个所述的启动子序列和至少一个所述的内含子序列功能性地连接于至少一个所述的核酸序列，并且其中所述的内含子对所述的核酸序列和/或对所述的启动子序列是异源的。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：HS·宋，C·达曼，M·莫拉，J·A·布朗，L·邢，H·贾，
申请(专利权)人：巴斯福植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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