AHAS突变体制造技术

本发明专利技术提供了编码包含至少两个突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)大亚基的突变体例如双重和三重突变体的核酸，用于产生对AHAS抑制型除草剂具有提高的耐受性水平的转基因植物或非转基因植物。本发明专利技术也提供了包含编码AHAS大亚基双重和三重突变体的多核苷酸的表达载体、细胞、植物；包含二种或多种AHAS大亚基单一突变多肽的植物；以及用于制备和使用它们的方法。

AHAS mutant

The present invention provides nucleic acids encoding mutants containing at least two large subunits of acetohydroxylate synthase (AHAS), such as double and triple mutants, for producing genetically modified or non-genetically modified plants with improved tolerance to AHAS inhibitory herbicides. The present invention also provides expression vectors, cells and plants containing polynucleotides encoding double and triple mutants of the large subunit of AHAS, plants containing two or more single mutant polypeptides of the large subunit of AHAS, and methods for preparing and using them.

【技术实现步骤摘要】
AHAS突变体本申请是中国专利申请200880011500.8(其分案申请的申请号201410165607.5)的分案申请，原申请的申请日是2008年4月3日，专利技术名称是“AHAS突变体”。专利
本专利技术总体上涉及用于提高植物对乙酰羟酸合酶抑制型除草剂的耐受性的组合物和方法。专利技术背景乙酰羟酸合酶(AHAS；EC4.1.3.18，又称作乙酰乳酸合酶或ALS)是催化支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物化学合成的第一个酶(Singh(1999)“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成(Biosynthesisofvaline,leucineandisoleucine),”在PlantAminoAcids,SinghB.K.编辑,MarcelDekkerInc.NewYork,NewYork,第227-247页)。AHAS是结构不同的四种除草剂家族的作用位点，所述除草剂家族包括磺酰脲类(Tan等人(2005)PestManag.Sci.61:246-57；Mallory-Smith和Retzinger(2003)WeedTechnology17:620–626；LaRossa和Falco(1984)TrendsBiotechnol.2:158-161)、咪唑啉酮类(Shaver等人(1984),PlantPhysiol.76:545-546)、三唑并嘧啶类(Subramanian和Gerwick(1989)“通过三唑并嘧啶类抑制乙酰乳酸合酶(Inhibitionofacetolactatesynthasebytriazolopyrimidines),”于BiocatalysisinAgriculturalBiotechnology一书中,Whitaker,J.R.和Sonnet,P.E.编著,ACSSymposiumSeries,AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.,第277-288页)和嘧啶基氧基苯甲酸酯类(pyrimidyloxybenzoates)(Subramanian等人(1990)PlantPhysiol.94:239-244)。咪唑啉酮和磺酰脲除草剂在现代农业中广泛使用，原因是它们在极低应用率下的效力和在动物中相对无毒。通过抑制AHAS活性，这些除草剂家族还阻止包括许多杂草物种在内的易感植物的生长和发育。可商购的咪唑啉酮除草剂的一些实例是(咪草烟)、(灭草喹)和(灭草烟)。磺酰脲除草剂的实例是绿黄隆、甲黄隆、嘧黄隆、氯嘧黄隆、噻黄隆、苯黄隆、禾草苄混剂、烟嘧黄隆、胺苯黄隆、玉嘧黄隆、氟胺黄隆、醚苯黄隆、氟嘧黄隆、醚黄隆、磺氨黄隆(amidosulfiuon)、fluzasulfuron、啶咪黄隆、吡嘧黄隆和吡氯黄隆。由于咪唑啉酮类除草剂的高效力和低毒性，可以通过喷洒在植被顶部广泛区域来促进它们的应用。能够将除草剂喷洒到植被顶部广泛区域降低了与植物建立和维持相关的成本，并且减少了在此类化学剂使用前现场准备的需要。在目的耐受物种顶部喷洒也导致能够因竞争物种不存在而实现所需物种最大产量的潜力。然而，使用此类顶部喷洒技术的能力取决于喷洒区域中存在所需植被的咪唑啉酮抗性物种。在主要的农业作物中，一些豆科物种如大豆天然地抵抗咪唑啉酮除草剂，原因是它们能够迅速代谢所述除草剂化合物(Shaner和Robson(1985)WeedSci.33:469-471)。其它作物如谷物(Newhouse等人(1992)PlantPhysiol.100:882－886)和稻(Barrette等人(1989)CropSafenersforHerbicides,AcademicPress,NewYork,第195-220页)某种程度地对咪唑啉酮除草剂易感。对咪唑啉酮除草剂的差异敏感性取决于特定除草剂的化学性质和在每种植物中该化合物从有毒到无毒形式的差异性代谢(Shaner等人(1984)PlantPhysiol.76:545-546；Brown等人(1987)Pestic.Biochem.Physiol.27:24-29)。其它的植物生理学差异如吸收和运输也在敏感性中起到重要作用(Shaner和Robson(1985)WeedSci.33:469-471)。抵抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和三唑并嘧啶类的植物已经通过使用种子、小孢子、花粉和愈伤组织诱变法在玉米(Zeamays)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、欧洲油菜(Brassicanapus)(即卡诺拉油菜)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotianatabacum)、甜菜(Betavulgaris)和稻(Oryzasativa)中成功地产生(Sebastian等人(1989)CropSci.29:1403-1408；Swanson等人,1989Theor.Appl.Genet.78:525-530；Newhouse等人(1991)Theor.Appl.Genet.83:65-70；Sathasivan等人(1991)PlantPhysiol.97:1044-1050；Mourand等人(1993)J.Heredity84:91-96；Wright和Penner(1998)Theor.Appl.Genet.96:612-620；美国专利号5,545,822)。在全部情况下，单一的、部分显性的核基因赋予抗性。在普通小麦(TriticumaestivumL.cv.Fidel)的种子诱变后，先前也分离了4种抗咪唑啉酮的小麦植物(Newhouse等人(1992)PlantPhysiol.100:882-886)。遗传研究证实单一的、部分显性的基因赋予抗性。基于等位研究，作者得出结论：在4个所鉴定品系中的突变位于相同的基因座。Fidel栽培品种抗性基因之一被称作FS-4(Newhouse等人(1992)PlantPhysiol.100:882-886)。基于计算机的AHAS-抑制剂复合体三维构象建模法预测了在所提出的抑制剂结合袋中的几个氨基酸作为诱导突变有可能赋予选择性咪唑啉酮类抗性的位点(Ott等人(1996)J.Mol.Biol.263:359-368)。使用在所提出的AHAS酶结合位点中这些合理设计的突变中的一些突变产生的烟草植物事实上已经表现出针对单一类别除草剂的特异抗性(Ott等人(1996)J.Mol.Biol.263:359-368)。抵抗咪唑啉酮除草剂的植物也已经在众多专利中报道。美国专利号4,761,373、5,331,107、5,304,732、6,211,438、6,211,439和6,222,100总体上描述了改变的AHAS基因在植物中引起除草剂抗性的用途，并且具体公开了某些抗咪唑啉酮的玉米品系。美国专利号5,013,659公开了由于在一个或多个保守性区域中在至少一个氨基酸中的突变而表现除草剂抗性的植物。在那些文献中描述的突变编码针对咪唑啉酮和磺酰脲的交叉抗性或磺酰脲特异抗性，但是没有描述咪唑啉酮特异抗性。美国专利号5,731,180和美国专利号5,767,361讨论了在野生型单子叶植物AHAS氨基酸序列中具有单氨基酸替换(产生咪唑啉酮特异抗性)的分离的基因。另外，已经通过突变育种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组的或诱变的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)多核苷酸，其编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的且在SEQ ID NO:1第122位置处或SEQ ID NO:2第90位置处具有谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸替换的、或者编码所述多肽序列的进一步突变变体的AHASL多肽。

【技术特征摘要】
2007.04.04 US 60/910,0281.重组的或诱变的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)多核苷酸，其编码SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的且在SEQIDNO:1第122位置处或SEQIDNO:2第90位置处具有谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸替换的、或者编码所述多肽序列的进一步突变变体的AHASL多肽。2.(a)诱变的或重组的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)的编码核酸；或者(b)(a)和第二诱变的或重组的AHASL的编码核酸的组合，其中(i)核酸(a)编码SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸发生替换的AHASL多肽，具有在对应于SEQIDNO:2第90位置处的谷氨酰胺替换；和(ii)第二核酸(b)，和任选地核酸(a)，编码SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸发生替换的AHASL多肽，具有在对应于SEQIDNO:2第92位置处的亮氨酸或异亮氨酸替换。3.表达载体，其包含权利要求2所述的核酸或核酸的组合。4.纯化的AHASL蛋白，其由权利要求2所述的核酸或核酸的组合编码。5.控制作物植物附近的杂草的方法，包括：(i)在田间种植包含和表达权利要求2所述核酸或核酸的组合的植物或所述植物的种子，并生长来自其的作物植物；和(ii)施加所述植物耐受的、有效量的咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、或它们的混合物至田间杂草和至田间作物植物；或者至种植种子的田间，由此控制所述杂草。6.权利要求5所述的方法，其中所述咪唑啉酮除草剂选自咪草烟、甲灭草烟、甲氧咪草烟和灭草烟中的一种或多种。7.产生转基因植物的方法，包括步骤：(a)用包含权利要求2所述的核酸或核酸的组合的表达载体转化植物细胞；和(b)从该植物细胞再生出表达由所述核酸或核酸的组合编码的AHASL多肽的转基因植物。8.鉴定或选择植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，包括：(a)提供包含权利要求2所述的核酸的植物细胞、植物组织、植物或其部分；(b)使所述植物细胞、植物组织、植物或其部分与至少一种AHAS抑制性化合物接触；和(c)确定所述植物细...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·麦克尔利文，B·辛格，
申请(专利权)人：巴斯福植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE