本发明专利技术提供了一种2‑苯乙酰‑苯并咪唑‑7‑羧酸合成酶基因StBI，基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示，2‑苯乙酰‑苯并咪唑‑7‑羧酸合成酶基因StBI翻译后得到的2‑苯乙酰‑苯并咪唑‑7‑羧酸合成酶，包含有2‑苯乙酰‑苯并咪唑‑7‑羧酸合成酶基因StBI的重组菌发酵后能够合成2‑苯乙酰‑苯并咪唑‑7‑羧酸，2‑苯乙酰‑苯并咪唑‑7‑羧酸具有疏水疏油性质，是一种黄色素，用于制备的染料，色牢度较好，不易因为与水、油的接触而掉色。
【技术实现步骤摘要】
一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶、其编码基因及其表达和应用
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶、其编码基因及其表达和应用。
技术介绍
近些年来，随着技术的进步和人民生活水平的提高，染料的应用越来越广泛，尤其是对于无毒环保染料的需求越来越大，这对染料工业的发展提出了更高的要求。目前的染料按其来源，主要可分为两大类：天然染料及合成染料。天然染料应用较早，且大多无毒环保，但存在着在自然界中含量有限、提取工艺复杂、生产成本高等局限性。合成染料与天然染料相比具有色泽鲜艳、不受原料来源限制、生产成本低等优点，但缺点在于合成染料大多结构复杂，生物毒性高，在自然界中很难降解或降解成本很高，对生态环境破坏较大。天然染料与合成染料的上述缺点严重制约了染料工业的迅速发展及其应用领域的进一步拓展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶、其编码基因及其表达和应用。为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案：一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶StBI，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，编码439个氨基酸。本专利技术还提供一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因，所述基因编码氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶。优选的，所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因的碱基序列如SEQIDNo.1所示，命名为基因StBI，基因全长1381bp。本专利技术还提供一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI的制备方法：以纯化的玉蜀黍赤霉(FusariumgraminearumPH-1)ATCCMYA-4620的基因组DNA作为模板，使用引物A1：5’-CGGGATCCCTCAGCGCCTGTACAAAGACAC-3’和引A2：5’-CGGAATTCCTAGTCATCCTGTAAGCTGATGGTC-3’通过聚合酶链式反应扩增得到2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI。优选的，所述纯化的玉蜀黍赤霉(FusariumgraminearumPH-1)的方法为：用真菌基因组DNA提取试剂盒纯化菌株编号ATCCMYA-4620的玉蜀黍赤霉FusariumgraminearumPH-1的基因组DNA。相应的，本专利技术还提供包含所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI的重组载体、重组菌株以及表达所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶的方法。本专利技术提供了包含所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI的重组载体，制备方法包括以下步骤：将碱基序列如SEQIDNo.1所示的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI插入到质粒pYES2上的BamHI和EcoRI限制性酶切位点之间，得到重组质粒pYES2-StBI，再将重组重组质粒pYES2-StBI转入。本专利技术还提供一种包含所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI的重组菌，优选的重组菌为工程菌S(Saccharomycescerevisiae)，该菌于2018年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，保藏编号：GDMCCNO：60415。本专利技术还提供一种包含所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI的重组菌株，优选的重组菌为工程菌S(Saccharomycescerevisiae)的菌株。本专利技术还提供一种包含所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI的重组菌的制备方法，将重组质粒pYES2-StBI转化进入酿酒酵母工程菌INVSc1中，得到的重组菌，命名为工程菌S(Saccharomycescerevisiae)。本专利技术还提供一种表达2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶StBI的方法，所述方法为：将包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI的重组菌在培养基上发酵，使2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶表达，发酵结束后回收并纯化所表达的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶。优选的，所述包含包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI的重组菌为工程菌S(Saccharomycescerevisiae)。优选的，所述培养发酵方法包含以下步骤：(1)吸取重组菌，即工程菌S(Saccharomycescerevisiae)的种子培养液加入到培养基之中，于25-30℃，摇床发酵培养；(2)发酵过程中，检测600nm波长下发酵液的吸光度，待发酵液600nm波长下吸光度达到0.4-1.0时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨至发酵液中，并将发酵液置于25-30℃，摇床中发酵培养。优选的，所述培养基为SC培养基，所述SC培养基组分包括：占SC培养基质量的选择性氨基酸混合物(-Ura)0.062％、无氨基酸酵母氮源基础6.4％、葡萄糖2％，所述SC培养基的pH5.5。优选的，加入添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨后，摇床发酵培养12-120小时。优选的，待发酵液600nm波长下吸光度达到0.8时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨至发酵液中。优选的，发酵培养的温度为28℃。优选的，加入添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨后，发酵培养的时间为72小时。优选的，发酵过程中摇床的频率为200rpm。优选的，制备工程菌S(Saccharomycescerevisiae)的种子培养液的方法为：从保存有工程菌S的固体培养基上挑取单个菌落于5mL的SC培养基之中，于28℃，200rpm摇床中培养24小时，即得工程菌S的种子培养液。本专利技术还提供一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶StBI在制备2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸中的应用。本专利技术还提供一种包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI的重组菌在制备2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸中的应用。本专利技术还提供一种工程菌S(Saccharomycescerevisiae)在制备2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸中的应用。优选的，所述制备2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的应用方法，包括以下步骤：(1)包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因StBI的重组菌在培养基上发酵，使2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶表达；(2)回收并纯化2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸。优选的，回收并纯化2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的方法包括以下步骤：(1)用氯仿萃取发酵后除去重组菌细胞的发酵液，得到包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的粗提物；(2)将包含2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸的粗提物干燥至恒重；(3)干燥后的粗提物过硅胶柱，用氯仿洗脱并收集馏分；(4)将氯仿馏分干燥，将干燥得到的固体依次用甲醇、乙酸乙酯、正己烷采用洗涤、离心、弃上清液的方法除去有机杂质得到纯净的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸。应用制备得到的2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸具有疏水疏油的特性，其用于制备的染料，色牢度较好，不易因为与水、油的接触而掉色。更优选的，所述步骤(4)中洗涤、离心、弃上清液的离心的方法为21000×g离心10分钟。优选的，发酵后除去重组菌细胞的发酵液的方法是：850×g离心5分钟。优选的，优选的回收纯化本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种2‑苯乙酰‑苯并咪唑‑7‑羧酸合成酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一种编码如权利要求1所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶的基因，其特征在于，所述基因的碱基序列如SEQIDNo.1所示。3.一种2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因的制备方法：以纯化的玉蜀黍赤霉的基因组DNA作为模板，使用引物A1：5’-CGGGATCCCTCAGCGCCTGTACAAAGACAC-3’和引物A2：5’-CGGAATTCCTAGTCATCCTGTAAGCTGATGGTC-3’通过聚合酶链式反应扩增得到2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因。4.一种包含如权利要求2所述2-苯乙酰-苯并咪唑-7-羧酸合成酶基因的重组载体。5.根据权利要求4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙磊，吴婉琪，
申请(专利权)人：广州中医药大学广州中医药研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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