检测变应原蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的方法，包括：通过化学修饰保护待测样品中的蛋白质的游离ＳＨ基；断裂ＳＨ基被保护的蛋白质的二硫键以暴露ＳＨ基；和检测暴露的ＳＨ基。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测蛋白质的方法，特别涉及一种。
技术介绍
变应原蛋白质广泛存在于我们的生活环境中。变应原蛋白质显示导致食物变态反应、家尘变态反应、花粉病等的有害作用，并且有时诱导例如过敏反应的致命症状。为了说明变态反应的发作机制并开发一种针对变态反应的保护性方法，广泛地筛选变应原蛋白质是一个重要目标。作为常规的筛选变应原蛋白质的方法，利用一种基于免疫印迹法的检测方法，它包括将蛋白质转移到膜如硝化纤维类或PVDF上、让蛋白质与变态反应病人血清中的IgE抗体反应以及随后检测结合到蛋白质上的抗体(例如，Weiss，W.等，Electrophoresis，18，826-833(1977))。当利用这种方法时，以极小量存在的变应原蛋白质在转移到膜上后容易损失，表明一些重要的变应原蛋白质可能被忽略并且仍然未得到检测。因此，需要一种不需任何印迹法。同时，作为一种检测蛋白质的一般方法，常规地使用一种包括将含有蛋白质的样品进行二维电泳(O’Farrell，P.H.等，Journal ofBiological Chemistry，250，4007-4021(1975))并且通过利用例如银染、染料染色(考马斯染色)、负染色或荧光染色的染色凝胶来显现蛋白质的方法。另外，还使用一种已知的方法，它包括预先将样品中的蛋白质还原、利用monobromobimane将蛋白质进行荧光标记、将经标记的蛋白质进行二维电泳以及显现荧光信号，由此以高度灵敏性检测蛋白质(Urwin，V.E.，和Jackson，P.，Anal.Biochem.209，57-62(1993))。但是，没有能够以高度灵敏性检测变应原蛋白质的已知方法。
技术实现思路
本申请要求日本专利申请号2002-236048的优先权，本文引入它的说明书/附图中的内容。本专利技术的一个目的是提供一种以高度灵敏性检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的方法。作为实现以上目的的透彻研究的结果，我们已开发了一种通过保护侍测样品中的蛋白质的游离SH基、断裂蛋白质的二硫键以暴露形成该键的SH基以及随后检测暴露的SH基，来检测具有二硫键的蛋白质的方法。基于这些结果完成的本专利技术如下一种检测具有二硫键的蛋白质的方法，包括通过化学修饰保护待测样品中蛋白质的游离SH基；断裂游离SH基受保护的蛋白质的二硫键以暴露SH基；以及检测暴露的SH基。在本方法中，优选通过将暴露的SH基与一种SH基标记物质反应以及检测经标记的SH基来检测暴露的SH基。在这种情况中，优选在检测经标记的SH基之前，通过二维电泳分离待测样品中的蛋白质。在本方法中，特别优选用碘乙酰胺的烷基化作用来化学修饰游离SH基并使用monobromobimane作为一种SH基标记物质。一种，该方法利用根据上面的检测具有二硫键的蛋白质的方法。待测样品的优选的例子包括来自禾本科植物种子、花粉、螨和屋尘的蛋白质提取物。一种检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的试剂盒，包含一种SH基保护剂和一种SH基检测物质。一种检测具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质的试剂盒，包含碘乙酰胺和monobromobimane。和的试剂盒可以进一步包含一种还原剂。本专利技术的方法一般能够通过，但不限于，例如下列(A)到(C)的步骤来实施。附图说明图1以示意图表示这些步骤。(A)将待测样品中的蛋白质与一种SH基保护剂反应的步骤。在该步骤中，蛋白质的游离SH基经化学修饰从而失去其反应性并进入一种被保护的状态(图1)。(B)将游离SH基受保护的蛋白质与一种还原剂反应的步骤。因而，蛋白质的二硫键(在图1中表示为“S-S”)得到断裂，并且形成二硫键的SH基随后被暴露(图1)。(C)将具有暴露的SH基的蛋白质与SH基标记物质反应的步骤，从而仅标记蛋白质的这种暴露的SH基(图1)。随后，通过检测经标记的SH基，检测具有暴露的SH基的蛋白质。以这种方式检测的蛋白质鉴定为具有二硫键的蛋白质。根据本专利技术的方法，能够以高度灵敏性特定地检测具有二硫键的蛋白质。而且，当将这种检测具有二硫键的蛋白质的方法应用于检测一种变应原蛋白质时，待测样品中的变应原蛋白质能够进行有效地检测。根据本专利技术的，通过常规筛选变应原蛋白质的方法难以检测的以极小量存在的变应原蛋白质也能够以高度的灵敏性进行检测。本专利技术详述如下。1.本文所用的基本术语的定义在本说明书中，下列术语根据如下定义的意思进行使用。(1)“蛋白质”理论上意指一种通过氨基酸之间的缩合而产生的多肽链或肽链。但是，本专利技术中的“蛋白质”不但包括简单的蛋白质，由它通过水解仅产生氨基酸，也包括缀合的蛋白质，由它通过水解产生氨基酸和除了氨基酸之外的有机物(例如，核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白和色蛋白)，和可诱导蛋白质(例如，明胶、蛋白胨和 )。可以对这些蛋白质进行进一步酶学地和化学地修饰。(2)“具有二硫键的蛋白质”意指一种蛋白质，其中在蛋白质分子内或蛋白质分子间于非还原条件下形成一个二硫键。该二硫键可以是一个在蛋白质中体内形成的二硫键或者可以是一个并非在体内形成的二硫键。(3)“变应原”意指一种引发人或哺乳动物中变态反应的抗原性物质。“变应原蛋白质”意指一种能够引发人或哺乳动物中变态反应的蛋白质(即，一种作用为变应原的蛋白质)。一种变应原蛋白质可以是由一个基因通过转录和翻译产生的生长蛋白质或其一个片段。此外，一种物质的“变应原性”意指诱导人或哺乳动物中变态反应的能力。(4)“SH基”意指一种蛋白质的硫氢基。通常，这种基团也可以称为硫羟基或巯基。2.检测具有二硫键的蛋白质的方法(1)待测样品在本说明书中，将本专利技术的方法对其进行应用的蛋白质称为“待测样品”。作为一种待测样品，只要它被怀疑含有具有二硫键的蛋白质或变应原蛋白质，任何样品都能够使用。待测样品可以包含一种蛋白质或几种蛋白质。待测样品也可以包含未分离的蛋白质或预先分离的蛋白质。待测样品可以仅由预先分离的蛋白质组成。待测样品的例子包括食物、药物、医学材料、化妆品、纺织品、建筑材料、环境检测样品(例如，空气、水和土壤样品)、植物样品、动物样品、变应原候选物、已知的变应原、已知的变应原蛋白质和研究样品(例如，预期其中具有二硫键形成的蛋白质)。具体的样品包括但不限于由例如鱼、肉、乳产品(例如，奶、酸牛乳和干酪)、含蛋产品(例如，蛋黄酱、蛋糕和鸡蛋面)、预制食物、调味料、香料、营养补充物、毛产品、羽产品、家尘、螨(例如，粉尘螨(Dermatophagoides farinae)和屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus))、花粉(例如，香柏花粉和豚草花粉)、食物变应原(例如，禾本科植物如水稻和小麦的种子、荞麦、大豆、清蛋白和奶)、来自动物(例如，狗、猫、小鼠、大鼠、马和牛)的变应原、来自植物(例如，花生和漆树)的变应原、昆虫变应原、寄生虫变应原或霉菌变应原制备的蛋白质提取物。另外的待测样品的例子包括纯化的蛋白质如卵清蛋白、卵类粘蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、螨抗原(例如，粉尘螨抗原)、牛血清清蛋白、胰蛋白酶/淀粉酶抑制物、谷蛋白、α-球蛋白、大豆球蛋白、分离的天然蛋白质、重组蛋白质、具有改变的天然氨基酸序列的蛋白质、合成的蛋白质和变应原候选蛋白质。这些待测样品可以单独使用或可以进行结合并用于一个单一的样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测具有二硫键的蛋白质的方法，包括：通过化学修饰保护待测样品中的蛋白质的游离ＳＨ基；断裂游离ＳＨ基受保护的蛋白质的二硫键以暴露ＳＨ基；和检测暴露的ＳＨ基。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：矢野裕之，黑田秧，
申请(专利权)人：独立行政法人农业生物系特定产业技术研究机构，
类型：发明
国别省市：JP[日本]