一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法技术

本发明专利技术属于棉花基因工程技术领域，具体涉及一种高效快速的农杆菌介导的棉花瞬时转化体系的建立。该方法具体包括制备瞬时转化溶液、培养棉花幼苗并进行高渗预处理、瞬时转化处理等步骤。本申请所提供的棉花瞬时转化方法中，主要是利用渗透作用使农杆菌侵染幼苗，从而将外源基因携带至棉花中，进而在棉花中表达转入的基因。总体而言，该方法具有成本低廉、操作方便、转化效率高等优点，可以为棉花中基因功能研究奠定方法学基础，同时也可为棉花功能基因在棉花中的亚细胞定位和相互作用提供参考方法，因而具有较好的实用性和科研应用价值。

A method of transient transformation of cotton mediated by Agrobacterium tumefaciens

The invention belongs to the technical field of cotton gene engineering, and specifically relates to the establishment of an efficient and rapid Agrobacterium mediated transient transformation system of cotton. The method includes the preparation of instantaneous conversion solution, the cultivation of cotton seedlings, hypertonic pretreatment, transient transformation and other steps. In the cotton transient transformation method provided by this application, we mainly use osmosis to enable the agrobacterium to infect the seedlings, so that we can carry exogenous genes to cotton, and then express the transferred genes in cotton. Overall, this method has the advantages of low cost, convenient operation, high conversion efficiency, can learn the basis for gene function research in cotton lay method, but also the subcellular localization for cotton functional gene in cotton and interactions in the reference method, so it has good practical application value and scientific research.

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法
本专利技术属于棉花基因工程
，具体涉及一种高效快速的农杆菌介导的棉花瞬时转化体系的建立。
技术介绍
棉花是食用油、蛋白和纤维的重要原料，因此是一种重要的经济作物。全世界有超过80个国家种植棉花，包括美国、中国、印度和许多其他的发展中国家。虽然我国广泛种植棉花，但随着我国对原棉的需求日益增加，仅依靠扩大耕地面积提高总产量是不现实的。棉花是一种非常容易感染病虫害的农作物，现有研究普遍认为培育转基因棉花是解决产量和生态环境问题最根本和最有效的方式。从上个世纪开始，转基因抗虫棉被广泛种植于世界各地。自2015年中国农业科学院棉花研究所揭示陆地棉的全基因组序列以来，对棉花功能基因的研究进入了新的高潮。而伴随基因编辑技术的广泛应用，有望克隆与揭示许多棉花基因的功能。但已有转基因棉花育种方式中，传统的依赖农杆菌介导的转基因棉花的转化效率非常低。相对于烟草和大豆等其他作物，成功获得的转基因棉花的数量非常少。因而现有转基因技术的低转化率较大程度上限制了基因功能的揭示和深入研究。现有的农杆菌介导的转基因转化方法，其主要发展历程为：1979年Price和Smith报道通过克劳茨基棉细胞悬浮培养得到胚状体；1986年，美国Agracetus公司的Umbeck通过农杆菌介导法，在世界上首次成功的将Bt基因导入了棉花；而我国早在1991年就已有将外源Bt基因导入棉株中的报道。总体而言，现有获得转基因棉花的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管导入法等。其中采用农杆菌介导法进行转化，转化效率偏低，转化细胞直接分化成植株比较难；而基因枪法最大的特点就是不受受体基因型影响，但是容易形成多拷贝造成基因沉默或者容易形成嵌合体，应用并不广泛。获得转基因棉花的方法还有很多，例如PEG介导法、脂质体介导法、超声波介导法、电激法、注射法、浸泡法等，但转基因的效率受到多种因素的影响，包括植物品种，生长时期，生长环境和转化方法等。另外，由于棉花花器官的特殊构造和农杆菌转化受基因型的限制，国内有些研究机构也有采用花粉管通道技术培育转基因棉花的尝试。总之，不管是农业生产，还是对棉花基因功能的研究，都需要建立一种稳定、高效、简单的棉花转基因的方法，从而为农业生产和理论研究方面提供方法学基础。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种高效、简单和快速的农杆菌介导的棉花瞬时转化的方法，从而为同源基因或异源基因在棉花中的表达提供方法学研究基础，同时也可以为棉花功能基因在棉花中的亚细胞定位和相互作用研究奠定方法学基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法，具体包括如下步骤：（1）制备瞬时转化溶液将含有待转化基因（待测基因）的重组质粒转化农杆菌后，将重组的农杆菌在YEP液体培养基中摇瓶培养，培养结束后，离心、收集菌体，用重悬液重悬菌体，调整OD600=0.8~1.0作为瞬时转化溶液；所述重悬液为1/2MS培养液（pH=5.8），其中含有150~170μM乙酰丁香酮、2~4%（w/v）蔗糖和0.01~0.02%（v/v）的Tween20（优选比例为：165μM乙酰丁香酮、3%（w/v）蔗糖和0.01%（v/v）的Tween20）；以具体目标基因和质粒为例而言：分别将pGhGPX1pro-GUS、p35S-GhGPX1-GFP、pGhGPX8pro-GUS和p35S-GhGPX8-GFP质粒转化EHA105农杆菌后，将转化后重组的EHA105农杆菌菌株分别在YEP液体培养基（含50mg/L卡纳霉素和50mg/L利福平）中培养，28℃、220rpm摇瓶培养16~17h左右；然后，取2mL培养的菌液，添加到YEP液体培养基，培养至菌液浓度OD600约为1.2~1.5，2000g离心10min，收集农杆菌；用重悬液（优选配方为：含有165μM乙酰丁香酮、3%（w/v）蔗糖和0.01%（v/v）的Tween20的1/2MS（pH=5.8））调节农杆菌浓度至OD600=0.8~1.0左右，该溶液即为瞬时转化溶液；（2）培养棉花幼苗，并进行高渗预处理将棉花种子播种后，取生长6~8天左右的棉花幼苗，清洗、消毒后，置于高渗液中进行高渗预处理；所述高渗液配方为：含乙酰丁香酮和蔗糖的1/2MS溶液，具体例如为：含165μM乙酰丁香酮和3%蔗糖，pH=5.8的1/2MS溶液；所述高渗液的渗透压力优选为0.7~0.75kg/cm2，高渗预处理时间优选为3min左右；所述棉花材料具体例如为：中棉所36；（3）瞬时转化处理将步骤（2）中高渗处理后的幼苗放入步骤（1）中的瞬时转化溶液中浸渍培养，优选培养条件为：25℃、120rpm（最好提供适宜光照）培养5h左右（超过5h或无光照条件下，幼苗容易死亡）；培养结束后，将转化后的幼苗清洗干净，置于含有抗生素和0.8%（w/v）琼脂粉的1/2MS培养基中继续培养生长；培养条件为：光周期16h光照/8h黑暗，光强为80~90μmolm-2s-1，培养温度为：日25℃/夜20℃；培养5天后即可进行基因表达检测或其他分析，或者继续培养即可用于转基因植株培育；需要注意的是，培养期间如果幼苗周围出现农杆菌菌落，需将植株移至另一个新鲜的培养基中进行培养。所述农杆菌介导的棉花瞬时转化方法，也可以理解为一种转基因植株构建方法。所述农杆菌介导的棉花瞬时转化方法在转基因植株构建中的应用，用于构建获得转基因棉花新品种。所述农杆菌介导的棉花瞬时转化方法在棉花研究中应用，用于基因表达模式研究和蛋白质的亚细胞定位研究。本申请所提供的棉花瞬时转化方法中，主要是利用渗透作用使农杆菌侵染幼苗，从而将外源基因携带至棉花中，进而在棉花中表达转入的基因。总体而言，该方法具有成本低廉、操作方便、转化效率高等优点，可以为棉花中基因功能研究奠定方法学基础，同时也可为棉花功能基因在棉花中的亚细胞定位和相互作用提供参考方法，如利用双分子荧光互补体系（黄色荧光蛋白，YFP）或荧光素酶（LUC），结合本申请的瞬时转化方法，即可检测棉花蛋白在体内的亚细胞定位和相互作用等，因而具有较好的实用性和科研应用价值。附图说明图1为本申请所提供的农杆菌介导棉花瞬时转化流程的模式图，其中EHA105为转化所用农杆菌，GFP为绿色荧光蛋白，GUS为β-葡萄糖苷酶，kan+为卡那霉素；图2为转化过程中的陆地棉照片，其中：A，生长7天用于转化的棉花材料；B，以转化溶液进行转化的陆地棉；C，转化后在筛选培养基中生长的陆地棉；图3为超表达GhGPX1和GhGPX8的不同植物中，实时荧光定量PCR检测GhGPX1（A）和GhGPX8（B）表达量；其中误差表示实验进行了至少三次单独的重复，以Student’st-test分析数据差异显著性，**P<0.01；图4为GhGPX1和GhGPX8基因表达特征分析，其中：检测GhGPX1（A）和GhGPX8（B）的启动子驱动的β-葡萄糖苷酶（GUS）活性；a，b和c分别为基因在叶子、茎和根中的表达特征；C和D分别为提取同时期棉花根尖、根、茎、子叶和真叶的RNA，利用荧光定量PCR检测不同组织中GhGPX1（C）和GhGPX8（D）的表达模式；图5为陆地棉中GhGPX1（A）和GhGPX8（B）的亚细胞定位分析；其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）制备瞬时转化溶液将含有待转化基因的重组质粒转化农杆菌后，将重组的农杆菌在YEP液体培养基中摇瓶培养，培养结束后，离心、收集菌体，用重悬液重悬菌体，调整OD600=0.8~1.0作为瞬时转化溶液；所述重悬液为1/2 MS溶液，其中含有150~170 μM乙酰丁香酮、2~4%（w/v）蔗糖和0.01~0.02%（v/v）的Tween20；（2）培养棉花幼苗，并进行高渗预处理将棉花种子播种后，取生长6~8天左右的棉花幼苗，清洗、消毒后，置于高渗液中进行高渗预处理；所述高渗液配方为：含乙酰丁香酮和蔗糖的1/2 MS溶液；（3）瞬时转化处理将步骤（2）中高渗处理后的幼苗放入步骤（1）中的瞬时转化溶液中浸渍培养；培养结束后，将转化后的幼苗清洗干净后，置于含有抗生素和0.8%（w/v）琼脂粉的1/2 MS溶液中继续培养。

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的棉花瞬时转化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）制备瞬时转化溶液将含有待转化基因的重组质粒转化农杆菌后，将重组的农杆菌在YEP液体培养基中摇瓶培养，培养结束后，离心、收集菌体，用重悬液重悬菌体，调整OD600=0.8~1.0作为瞬时转化溶液；所述重悬液为1/2MS溶液，其中含有150~170μM乙酰丁香酮、2~4%（w/v）蔗糖和0.01~0.02%（v/v）的Tween20；（2）培养棉花幼苗，并进行高渗预处理将棉花种子播种后，取生长6~8天左右的棉花幼苗，清洗、消毒后，置于高渗液中进行高渗预处理；所述高渗液配方为：含乙酰丁香酮和蔗糖的1/2MS溶液；（3）瞬时转化处理将步骤（2）中高渗处理后的幼苗放入步骤（1）中的瞬时转化溶液中浸渍培养；培养结束后，将转化后的幼苗清洗干净后，置于含有抗生素和0.8%（w/v）琼脂粉的1/2MS溶液中继续培养。2.如权利要求1所述农杆菌介导的棉花瞬时转化方法，其特征在于，步骤（1）中，重悬液为1/2MS培养液，其中含有165μM乙酰丁香酮、3%（w/v）蔗糖和...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗雨晨，李坤，李海鹏，郭玉涛，郭敬功，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南,41