一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法技术

一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，涉及一种毛果杨转基因方法。是要解决现有毛果杨遗传转化方法的抗性筛选基因单一问题，以及诱导抗性芽出现的假阳性及畸形问题。方法：一、选取毛果杨的无菌苗茎段作为转化受体材料；二、活化携带PHSE401载体的农杆菌；三、将转化受体材料放入悬浮菌液中侵染；四、将侵染后的受体材料接种到共培养基上培养；五、共培养的受体材料脱菌处理后，再经筛选培养获得抗性芽；六、将抗性芽培养得抗性植株；七、检验；八、移栽。本方法以毛果杨无菌苗茎段作为转化受体材料直接诱导形成抗性芽，极大地缩短了这个重要模式树种转基因的周期，且不存在畸形和假阳性的情况。本发明专利技术用于毛果杨转基因领域。

A rapid transgene method based on hygromycin screening of poplar poplar

A rapid transgenic method based on the hygromycin screening of poplar poplar, which involves a transgenic method of poplar poplar. It is to solve the single problem of resistance screening genes in the existing genetic transformation of Populus hairy poplar, as well as the false positive and malformation of the induction of resistant buds. Method: first, select sterile seedling stems of Populus trichocarpa as transformation receptor materials; two, activation of carrying PHSE401 Agrobacterium tumefaciens; three, transformed receptor materials into infected bacteria suspended in liquid; four, the receptor material after infection of inoculation to the co culture medium; five, co culture receptor material the removal of bacteria treated by screening culture resistant buds; six, cultivate resistant buds, seven resistant plants; inspection; eight, transplanting. In this method, the stem segments of hairy poplar seedlings were directly induced to form resistant buds, which greatly shortened the transgenic cycle of this important tree species, and there was no deformity or false-positive condition. The invention is used in the field of transgenic hairy poplar.

【技术实现步骤摘要】
一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法
本专利技术涉及一种毛果杨转基因方法。
技术介绍
毛果杨(PopulustrichocarpaTorr.Gray)也叫测序杨，是杨属青杨派树种，也是第一个被全基因组测序的树种，测序结果于2006年发表在《Science》期刊上。因此，毛果杨已成为研究林木生长发育特性、生理生态功能的模式树种，然而，已被报道的林木基因功能及作用机制研究，大多数是在杂交杨中开展的，鲜有以毛果杨为遗传材料的，这是由于现有的毛果杨转基因技术较杂交杨困难所致，这对模式树种毛果杨基因资源利用造成了极大的阻碍。目前，关于毛果杨遗传转化的报道已有四篇。其中一篇于2004年发表在PlantMolecularBiologyReporter期刊上，该报道中毛果杨的遗传转化包括诱导抗性愈伤和抗性芽再生两个过程，首先由无菌苗茎段外植体在植物生长调节剂萘乙酸和2ip作用下诱导抗性愈伤，抗性愈伤再经不同浓度的噻苯隆诱导抗性芽。其中两篇由同一科研团队分别于2006、2015年发表在PlantCellPhysiology、MethodsMolecularBiology期刊上，该报道中毛果杨遗传转本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于该方法包括以下步骤：一、选取培养25‑35d的毛果杨的无菌苗茎段作为转化受体材料；二、挑取单个携带PHSE401载体的农杆菌菌落，接入YEP液体培养基中活化，得到活化好的农杆菌菌液；所述PHSE401载体的RB至LB区域携带guide RNA、cas基因及潮霉素磷酸转移酶基因；三、将活化好的农杆菌菌液离心，倒掉上清，用悬浮液重悬菌体得到悬浮菌液，然后将步骤一的转化受体材料放入悬浮菌液中进行侵染；四、将转化受体材料从悬浮菌液中取出，接种到共培养基上，暗培养2～3d，培养温度为23～25℃；五、将步骤四共培养后的受体材料经过脱菌处理后，先接种到不...

【技术特征摘要】
1.一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于该方法包括以下步骤：一、选取培养25-35d的毛果杨的无菌苗茎段作为转化受体材料；二、挑取单个携带PHSE401载体的农杆菌菌落，接入YEP液体培养基中活化，得到活化好的农杆菌菌液；所述PHSE401载体的RB至LB区域携带guideRNA、cas基因及潮霉素磷酸转移酶基因；三、将活化好的农杆菌菌液离心，倒掉上清，用悬浮液重悬菌体得到悬浮菌液，然后将步骤一的转化受体材料放入悬浮菌液中进行侵染；四、将转化受体材料从悬浮菌液中取出，接种到共培养基上，暗培养2～3d，培养温度为23～25℃；五、将步骤四共培养后的受体材料经过脱菌处理后，先接种到不定芽筛选初期培养基上，在23～25℃下光培养20～30d，然后转接至后期筛选培养基上，在23～25℃下光培养20～30d，获得抗性芽；六、待抗性芽的茎长为0.9～1.1cm时，将抗性芽转接至生根筛选培养基中，23～25℃下光培养，获得抗性植株；七、对步骤六获得的抗性植株进行检验，检验结果为阳性的即为转基因植株；八、对步骤七获得的转基因植株进行移栽。2.根据权利要求1所述的一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于步骤一中受体材料选择的具体要求是：选取培养25-35d长势较好的毛果杨无菌苗，切下形态学自上而下第二、三、四茎节，再将其切成0.8-1.0cm的小段作为转化受体材料。3.根据权利要求1或2所述的一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于步骤三中所述悬浮液的配制方法是：向含有20-25g/L蔗糖，且pH值为5.0-5.8的1/2WPM液体培养基中添加50-80μM乙酰丁香酮。4.根据权利要求3所述的一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法，其特征在于步骤三中侵染的时间为15-20min。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：程玉祥，甄成，徐文晶，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23