一种菠萝体细胞胚发生受体类激酶基因AcSERK1的遗传转化方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种菠萝体细胞胚发生受体类激酶基因

Genetic transformation of a pineapple somatic embryoid kinase gene AcSERK1 and its application

The invention discloses a kind of receptor like kinase gene in pineapple somatic embryogenesis

【技术实现步骤摘要】
一种菠萝体细胞胚发生受体类激酶基因AcSERK1的遗传转化方法及其应用
本专利技术涉及一种菠萝体细胞胚发生受体类激酶基因AcSERK1的遗传转化方法及其在菠萝体细胞胚发生中的应用，属于生物

技术介绍
菠萝(Ananascomosus)亦称凤梨，是世界四大热带果树之一，也是我国主要的热带果树，除聚花果食用外，植株可供观赏、叶可分离纤维。世界各地的食用菠萝品种共计100余个，分为卡因、皇后、西班牙和波多黎各等四大类。菠萝是自交不亲和植物，不仅同一品种不亲和，甚至在同一大类中的不同品种间授粉都不能产生种子，果实采收后需以吸芽进行繁殖更新。由于多数优良栽培品种每株只能在开花后抽生1~3个大小不一的吸芽，不但芽苗的批量生产困难，还常导致子代群体的成熟期等不一致，严重阻碍了菠萝的良种繁育。虽然菠萝离体培养的器官再生技术已较成熟，但成本仍然太高，还不能像同样是多年生草本果树的香蕉那样在生产中普遍应用组培育苗。因此，研究菠萝体细胞胚(somaticembryo，SE)发生早期的相关基因及其功能，通过调控这类基因表达来建立高频率的体细胞胚发生体系，对其遗传改良、胚胎发育机理研究和工厂化育苗推本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菠萝体细胞胚发生受体类激酶基因AcSERK1的遗传转化方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）构建pFGC5941‑35s‑AcSERK1正义表达载体；（2）愈伤组织的制备及其对PPT的耐受性测试；（3）农杆菌侵染液的制备；（4）预培养、侵染、共培养及筛选培养：经MS悬浮的农杆菌液侵染预培养2d的受体愈伤组织，浸染3~5min，暗处培养3d后在含有PPT浓度分别为2、3、4mg/L的筛选培养基中进行三轮筛选，50d后获得PPT抗性苗；（5）PPT抗性苗生根与移栽。

【技术特征摘要】
1.一种菠萝体细胞胚发生受体类激酶基因AcSERK1的遗传转化方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）构建pFGC5941-35s-AcSERK1正义表达载体；（2）愈伤组织的制备及其对PPT的耐受性测试；（3）农杆菌侵染液的制备；（4）预培养、侵染、共培养及筛选培养：经MS悬浮的农杆菌液侵染预培养2d的受体愈伤组织，浸染3~5min，暗处培养3d后在含有PPT浓度分别为2、3、4mg/L的筛选培养基中进行三轮筛选，50d后获得PPT抗性苗；（5）PPT抗性苗生根与移栽。2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（1）构建pFGC5941-35s-AcSERK1正义表达载体，具体步骤是：根据AcSERK1的cDNA序列，设计带有NcoI和XbaI酶切位点的基因特异引物，以含有AcSERK1cDNA全长的pMD19-T为模板，扩增含有AcSERK1的ORF的目的片段，PCR产物用Takara回收试剂盒回收目的片段；用NcoI和XbaI同时对回收的PCR产物和pFGC-5941进行双酶切，分别回收后进行连接、转化及菌液PCR检测，阳性克隆进行测序鉴定，确认没有移码突变，获得重组正义表达载体，命名为pFGC5941-35s-AcSERK1，通过冻融法将其转入农杆菌菌株LBA4404中，于-80度冰箱保存。3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（2）愈伤组织受体材料的制备及其对PPT的耐受性测试，具体步骤是：选取菠萝组织，处理获得无菌材料，经培养获得愈伤组织受体材料；将愈伤组织受体材料和不同长度的不定芽接种到含有PPT的分化培养基中，观察其对PPT的敏感性，以未加入PPT的处理作为对照，10d后统计愈伤组织和不定芽在不同PPT浓度下死亡数和死亡率。4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（3）农杆菌侵染液的制备，具体步骤是：将含有AcSERK1的农杆菌划线培养于含50mg/LKm的YEB固体培养基平板上，于28℃，暗培养3d；挑取单菌落，于含有50mg/LKm的YEB液体培养基中，28℃下200rpm震荡培养36h，菌液浑浊呈鲜黄色，OD600为0.8～1.0；取1.0mL菌液加到不含抗生素，含有100μmol/LAS的新鲜YEB液体培养基，震荡培养4~6h，使OD600为0.3~0.5，得到扩繁的菌液，略显黄色、浑浊；将上述扩繁的菌液转入50mL无菌离心管中，5000rpm，4℃，离心10min，去除上清液，收集菌体；重悬于灭过菌、pH7.0的MS液体培养基中，稀释至OD600为0.4，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文天，何业华，高玉尧，马均，郭翠红，陈程杰，林文秋，
申请(专利权)人：华南农业大学，中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44