一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用，所述遗传体系是SIP1家族基因诱导植株矮化的遗传转化体系；所述体系的构建包括（1）番茄RNA的提取；（2）SlGT‑33基因的RNA反转录；（3）SlGT‑33基因的克隆及沉默表达载体的构建。所述体系的应用是用于诱导番茄植株矮化。本发明专利技术诱导植物矮化的遗传转化体系可用来培育番茄矮化植株，得到的番茄植株具有可高密度种植、充分利用空间和土地，增强光合效率，提高产量，低耗水率，抗倒伏等优点。

A genetic transformation system for inducing plant dwarfism and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用
本专利技术涉及一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用，特别是一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用该其培育番茄矮化植株的方法。
技术介绍
番茄(学名：SolanumlycopersicumMill.var)属于一年生或多年生草本植物，株高1-2米；羽状复叶或深裂；茎易倒伏；聚伞花序；浆果。番茄起源于南美洲的安第斯山地带，在秘鲁、厄瓜多尔等地仍有大部分野生种分布。番茄在长日照和短日照情况下均能生长、结实，适生温度范围较广，对土壤条件要求不严格，如今，番茄已作为世界范围栽种的主要蔬菜作物。植物矮化是一种重要的农艺性状，因其可高密度种植、充分利用空间和土地，增强光合效率，提高产量、低耗水率、抗倒伏等优势，对选育高产品种来说是一个重要的研究方向。诱导矮化的因素较多，包括栽培措施、生长环境、引种、生物调节剂、病毒及化学诱变等，而诱变过程中产生的安全性问题、诱变的长效性、透彻的机理分析等问题依然有局限性。番茄的矮化研究已从上个世纪的中叶便已开始，目前，植物矮化的探索逐步从生物调节剂分析向遗传基因的研究过渡，特别是发现了多种矮小型番茄突变品种，如Micro-Tom、TomThumb、Dwarfstone等。转基因技术是获得遗传稳定矮化品种的重要渠道。许多与矮化的相关基因被鉴定：赤霉素的合成、信号转导、代谢调控等途径中的蛋白编码基因突变后均可导致植株矮化，这与甾醇类激素、生长素、多胺等生物活性物质代谢合成途径中的基因变化相似。植物界中已发现的转录因子有60多种，如bHLH、MADS-box、MYB、WD40、WRKY、AP2/ERF、YABBY、HB-box和NAC等。Kato等发现，NAC家族转录因子ANAC036基因主要在拟南芥的叶片中表达，超表达ANAC036基因产生了半矮化的植株；水稻中，超表达CYTOKININ-RESPONSIVEGATATRANSCRIPTIONFACTOR1(Cga1)基因诱导植物叶片的叶绿素合成，并导致植物半矮化；油菜素类固醇信号途径中的HLH转录因子INCREASEDLEAFINCLINATION1BINDINGbHLH1(IBH1)基因的超表达导致植株的严重矮化；等。可见，在植物的生长发育调控中，转录因子发挥了至关重要的作用。然而，到目前为止，Trihelix转录因子家族的相关基因在培育矮化植株方面的贡献还未见报道。GT-1亚家族基因的功能研究进展：GT-1是首先被发现的Trihelix转录因子。GT元件首先在豌豆光响应基因rbs-3A启动子区发现并进行了分离，该启动子区为BoxII。继而，其他非光响应基因的启动子中也含有GT元件，如相似启动子序列(GT-2box和GT-3box)存在于水稻的phyA启动子中，它可在暗环境中激活相关基因的表达。GT-2亚家族基因的功能研究进展：GT-2的命名是源于它含有两个与GT-1同源的DNA结合域。该亚家族基因的功能较为强大，其主要功能与植物的抗逆性、花器官的发育有关。据报道，SH4亚家族基因的功能与离层的发育相关。GTγ亚家族基因的功能与植物的逆境胁迫相关。SIP1亚家族基因的功能研究发现：Kitakura等报道烟草NtSIP1作为Trihelix转录因子家族另一个亚家族基因被发现，它促进了6b蛋白与下游基因启动子的结合，实现了植物的细胞增殖。ASIL1(Arabidopsis6b-interactingprotein1-like1)与拟南芥2S3启动子区互作。asil1突变体积累了2S白蛋白和脂肪酸类油脂，这与种子中的脂类非常相似。Gao等研究表明ASIL1识别GT元件，与2S的RY重复非常接近。Kuromori等指出，SIP1亚家族中存在一个融合基因，即3’末端融合了天冬氨酸/谷氨酸盐/尿苷激酶的编码序列。在拟南芥和水稻中，这些基因在父母本中存在。虽然这种融合基因的功能还未确定，但它们诱导植株矮化，并形成浅绿和畸形的叶子。Geraldo等研究结果显示，只包含了coiled-coil结构的蛋白FRIGIDA(FRI)上调了开花抑制子FLOWERINGLOCUSC(FLC)的基因表达，导致植物必须接受春化处理和度过冬天的习惯。突变帽子结合蛋白cap-bindingcomplex(CBC)的小亚基抑制FRI的活性。CBC可与FRI在体内和体外直接互作，这种FRI与5’帽子结构的密切关系可以被RNA连接酶介导的迅速cDNA扩增来证实。缺失CBC20削弱了FLC的表达，提高了FLC剪切mRNA的含量。FRI可恢复这种缺失影响，并恢复部分FLC的表达以及剪切能力。虽然该基因与Trihelix家族并无直接联系，但coiled-coil结构使得它被分到了SIP1亚家族。然而，到目前为止，Trihelix转录因子家族SIP1亚家族基因诱导植物矮化的研究也未见报道。因此，现有技术中，培育番茄矮化植株还未见报道，使得现有番茄植株存在不能高密度种植，不能充分利用空间和土地，光合效率低，产量低，水率高，不抗倒伏等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建。本专利技术诱导植物矮化的遗传转化体系可用来培育番茄矮化植株，得到的番茄植株具有可高密度种植、充分利用空间和土地，增强光合效率，提高产量，低耗水率，抗倒伏等优点。本专利技术的技术方案：一种诱导植株矮化的遗传转化体系，所述遗传体系是SIP1家族基因诱导植株矮化的遗传转化体系。一种前述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法，包括(1)SlGT-33基因的RNA的提取；(2)SlGT-33基因的RNA反转录；(3)SlGT-33基因的克隆；(4)沉默载体的构建。前述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法中，所述的番茄RNA的提取；是番茄组织放入液氮中速冻10～20s后放入研钵，研磨后，取98-102mg粉末放入1.5mL离心管中，加入0.8-1.2mLRNAisoPlus提取试剂，震荡混匀，室温静置4-6min后，混合液在3-5℃下13100rpm离心4-6min，吸取上清液880-920μL放入到新1.5mL的离心管中，并加入三氯甲烷245-265μL，混匀后，常温静置4-6min；混合液3-5℃下12500-13500rpm离心13-17min，吸取最上层澄清液体180-220μL于新的1.5mL的离心管中，加入180-220μL浓度为99-100％的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置4-6min，将混合液3-5℃下13000-13200rpm离心8-12min，倒掉上清液，并加入1mL70乙醇，3-5℃下13000-13200rpm离心50-70s，倒掉上清液，吸干残留液体，常温静置干燥；待干燥后加入灭菌的无离子水20～30μl溶解，即得。前述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法中，所述的SlGT-33基因的RNA反转录；是在无菌的环境下，于灭菌的离心管中加入如下反应体系的试剂：番茄RNA0.8-1.2μL、引物1.8-2.2μL、无离子水10-12μL，将加好试剂的离心管放到PCR仪上，74-76℃孵育4-6min；孵育结束后迅速放到冰上冷却4-6min，并加入4-6倍的buffer缓冲液(5×ReactionBuff本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导植株矮化的遗传转化体系，其特征在于：所述遗传体系是SIP1家族基因诱导植株矮化的遗传转化体系。

【技术特征摘要】
1.一种诱导植株矮化的遗传转化体系，其特征在于：所述遗传体系是SIP1家族基因诱导植株矮化的遗传转化体系。2.一种如权利要求1所述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法，其特征在于：包括（1）番茄RNA的提取；（2）番茄总RNA反转录；（3）SlGT-33基因的克隆；（4）沉默载体的构建。3.如权利要求2所述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法，其特征在于：所述的番茄RNA的提取；是番茄组织放入液氮中速冻10~20s后放入研钵，研磨后，取98-102mg粉末放入1.5mL离心管中，加入0.8-1.2mLRNAisoPlus提取试剂，震荡混匀，室温静置4-6min后，混合液在3-5℃下13100rpm离心4-6min，吸取上清液880-920µL放入到新1.5mL的离心管中，并加入三氯甲烷245-265µL，混匀后，常温静置4-6min；混合液3-5℃下12500-13500rpm离心13-17min，吸取最上层澄清液体180-220µL于新的1.5mL的离心管中，加入180-220µL浓度为99-100%的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置4-6min，将混合液3-5℃下13000-13200rpm离心8-12min，倒掉上清液，并加入1mL70乙醇，3-5℃下13000-13200rpm离心50-70s，倒掉上清液，吸干残留液体，常温静置干燥；待干燥后加入灭菌的无离子水20~30µl溶解，即得。4.如权利要求2所述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法，其特征在于：所述的SlGT-33基因的RNA反转录；是在无菌的环境下，于灭菌的离心管中加入如下反应体系的试剂：番茄RNA0.8-1.2µL、引物1.8-2.2µL、无离子水10-12µL，将加好试剂的离心管放到PCR仪上，74-76℃孵育4-6min；孵育结束后迅速放到冰上冷却4-6min，并加入4-6倍的buffer缓冲液（5×ReactionBuffer）4µL、dNTP2µL、莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶0.8-1.2µL和无离子水8-10µL后，放在PCR上40-44℃温育50-70min，再升高到70-74℃孵育8-12min，取出，零下20℃保存；所述的引物是1.8-2.2mmoL/L的oligodT。5.如权利要求2所述的诱导植株矮化的遗传转化体系的构建方法，其特征在于：所述的SlGT-33基因的克隆；是利用引物SlGT-33-F和SlGT-33-R扩增番茄基因SlGT-33，反应体系试剂如下：2×PrimeSTARMix，12.5µL；SlGT-33-F，1.0µL；SlGT-33-R，1.0µL；cDNA模板1.0µL；无菌水9.5µL；加好后，在PCR仪上放置后进行扩增，扩增的条件如下：变性98℃，2min；复性58℃，30s，片段固定72℃，10min，得到PCR的扩增产物；所述的沉默载体的构建；是PCR的扩增产物连接到pMD18-T载体上，测序，获得克隆片段的编码序列，在5'加入了酶切位点，合成引物SlGT-33-F和SlGT-33-R，分别以正向和反向的方式连接到中间载体pHANNIBAL上，然后连接到终载体pBIN19上，获得含有SlGT-33基因的沉默表达终载体；所述的SlGT-33-F是：5'CTTCCTGTTCACGACCCTTC3'；所述的SlGT-33-R：5'CTCTCAATTTTGGACCCCC3'。6.一种如权利要求1-5中任一项所述的诱导植株矮化的遗传转化体系应用，其特征在于：用于诱导番茄植株矮化。7.如权利要求6所述的诱导植株矮化的遗传转化体系应用，其特征在于：所述的用于诱导番茄植株矮化；是SlGT-33基因转移到农杆菌和农杆菌侵染番茄子叶。8.如权利要求7所述的诱导植株矮化的遗传转化体系应用，其特征在于：所述的SlGT-33基因转移到农杆菌；...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔宝禄，
申请(专利权)人：黔南民族师范学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52