本发明专利技术属于植物生物技术领域，具体是一种高效快速的甘蔗转基因方法，其是以甘蔗的幼叶组织作为外植体诱导胚性愈伤组织，胚性愈伤组织作为农杆菌侵染的受体材料，通过先分化培养成胚状体、小芽和小苗后再进行抗性转化，获得抗性转化植株，然后提取抗性植株的ＤＮＡ、ＲＮＡ，进行ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ检测，经ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ检测为阳性的植株再移栽到大棚，待长大后再进行其它一些分子与生理生化的检测。本发明专利技术可大幅度提高转化效率，缩短转化的时间，只需４个月就可得到ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ检测为阳性的转基因植株，节约转化成本，因先进行ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ检测后才移栽，减少了大量假抗性苗的移栽和管理，也降低了实验成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物生物
，涉及一种甘蔗转基因育种方法，具体是。
技术介绍
甘蔗是全世界最为重要的糖料经济作物，也是我国热带、亚热带地区重要的糖料经济作物。目前我国是世界第三大产糖国，2008/2009榨季全国总产糖量达到1243万吨，其中甘蔗糖占总产糖量的94％。近年来甘蔗还发展成为一种重要的能源作物，是生产绿色燃料——酒精的重要原料。 由于现代甘蔗栽培种是甘蔗属热带种，割手密和印度种等物种的种间杂交种，在长期的高贵化育种过程中，减数分裂的异常使得现代甘蔗栽培种形成大量的非整倍体，其染色体数量多、基因组结构复杂、在同株中染色体倍数不同，同时由于甘蔗对光周期反应敏感，许多重要亲本在亚热带和温带地区很难开花，即使开花花粉数量也不足，而且经常与近缘植物的花期不遇，这给常规的抗逆育种带来许多困难。因此基因工程转基因技术成了甘蔗品种遗传改良的重要途径。 目前甘蔗的遗传转化技术主要有基因枪转化法和农杆菌介导法。早期甘蔗转基因植株的获得主要是采用基因枪转化法，但该法转化效率较低，嵌合体比较多，外源基因插入拷贝数比多，遗传稳定性比较差，转化成本高。1998年以来，世界多个实验室采用农杆菌介导法，获得很多种转基因植株。农杆菌介导法的优点在于外源基因插入的拷贝数低，对受体伤害小，而且实现了大片段DNA的转化。在农杆菌介导法的转化过程中，乙酰丁香酮的正确采用虽然大幅提高了农杆菌介导法的转化效率，但其转化效率约为3％，还是不能满足转基因工程的产业化发展需求，而且农杆菌介导法在甘蔗遗传转化中仍然存在不足(1)在甘蔗愈伤组织的采用上一直沿袭着早期基因枪转化法的愈伤继代诱导方式，愈伤本身分化效率偏低，直接影响了最后的转化效率；(2)在农杆菌与愈伤组织共培养后，很难将农杆菌彻底清除干净，导致分化培养与再生培养时期污染严重；(3)通常采用共培养后愈伤组织分化期即进行筛选，但因甘蔗愈伤组织分化的芽较小，抗性芽很难长高，导致在更换培养基过程中很难将抗性芽与被筛选剂杀死的芽区分开来。(4)转化时间较长，达6个月以上。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服原有农杆菌介导法甘蔗遗传转化技术的不足而提供，通过改变转化模式，大大提高了转化效率，缩短了转化的时间，节约了转化的成本。 本专利技术所采用的技术方案 ，包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程，农杆菌的活化及胚性愈伤组织的转化过程，胚性愈伤组织的分化再生及筛选过程，转化小植株DNA/RNA微量提取及PCR与RT-PCR鉴定过程 1、甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程以优良甘蔗栽培种的顶端生长点处的幼叶组织为外植体，外植体经消毒、无菌水冲洗、无菌滤纸吸干其表面的水分后切成薄片接种于诱导培养基上，于避光条件下进行培养至诱导出胚性愈伤组织。所述诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加1-2mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶。 2、农杆菌的活化及胚性愈伤组织的转化过程将含有目的基因的农杆菌EHA105单菌落接种到活化培养基中震荡培养，通过离心回收菌体，再重悬于等体积vir基因诱导培养基中继续震荡培养，以诱导农杆菌质粒vir基因的表达，此菌液即为转化用的农杆菌工程菌液；将甘蔗胚性愈伤组织转入农杆菌菌液中，浸泡后再接种于共培养培养基上于黑暗条件下共培养，然后接种于分化培养基上。所述活化培养基是以YEP为基础培养基，并添加相应抗生素Kan 50μg/mL，Str50μg/mL，Rif 50μg/mL。所述vir基因诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素修改为原含量的1/5，并添加1mg/L2.4-D、10mmol/L果糖、10mmol/L葡萄糖、30g/L蔗糖、100-150μmol/L乙酰丁香酮。所述共培养培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素修改为原含量的1/5，并添加1mg/L2.4-D、10mmol/L果糖、10mmol/L葡萄糖、30g/L蔗糖、100-150μmol/L乙酰丁香酮、卡拉胶20g/L。所述分化培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加1mg/L6-BA、0.2mg/LKT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶。 3、胚性愈伤组织的分化再生及筛选过程将接种于分化培养基上的胚性愈伤组织置于1500lux，14h/d光照条件下培养至胚状体形成，然后将胚状体更换到生芽培养基上，继续置于1500lux，14h/d光照条件下培养产生小芽，然后将小芽转接到成苗培养基上，1500lux，14h/d光照条件下培养至长成小苗，将长成0.5cm-3cm的小苗转接到抗性培养基上于1500lux，14h/d光照条件下培养18-25天获得抗性植株，将抗性植株单株单瓶按编号培养于壮苗生根培养基上进行抗性植株的生根壮苗培养18-25天。所述生芽培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加0.2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶。所述成苗培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶。所述抗性培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加5mg/LIBA、250ul/LPPT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶。所述壮苗生根培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加5mg/LIBA、250ul/LPPT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉胶、50-100ml/L椰子汁。 4、转化小植株DNA/RNA微量提取及PCR与RT-PCR鉴定过程按编号剪取单株单瓶培养于壮苗生根培养基上的抗性植株的叶片，剪碎后置于液氮中冷冻3-8秒，研碎，用CTAB法提取DNA，然后进行PCR检测。经PCR检测为阳性的植株用同样的方法提取RNA进行RT-PCR检测。最后将PCR及RT-PCR检测均呈阳性的植株从培养基中取出洗净炼苗后移栽到大棚。 本专利技术对甘蔗进行遗传转化的实验，所获数据列表如下 甘蔗转化效果数据 *注筛选效率＝检测阳性植株数量/筛选抗性植株数量 转化效率＝检测阳性植株数量/使用愈伤数量 从以上数据说明，本专利技术在甘蔗转基因育种领域将甘蔗农杆菌介导法的遗传转化效率提高到20％左右，大大优先于先前的3％；筛选效率达到了90％，转化时间也从原来的半年缩短到4个月左右。 本专利技术以甘蔗顶端生长点处的幼叶组织作为外植体诱导胚性愈伤组织，作为农杆菌侵染的受体材料，通过先分化培养，后进行高浓度的PPT筛选，获得抗性植株后，采用创新的DNA、RNA微量提取技术，提取抗性苗的DNA/RNA，然后进行PCR、RT-PCR检测，经PCR、RT-PCR检测为阳性的植株再移栽到大棚，待植株长大后再进行其它的分子与生理生化的检测。与已有技术相比，本专利技术可大幅度提高转化效率，缩短转化的时间，只需4个月就可得到PCR、RT-PCR检测为阳性的转基因植株，也降低了转化成本。 具体实施例方式 下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。 本专利技术包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程，农杆菌的活化及对甘蔗胚性愈伤组织的转化过程，转化后胚性愈伤组织的分化再生及筛选过程，转化小植株DNA、RNA微量提取及PCR与RT-PCR鉴定过程。 下面的实施例为利用本实验室构建好的植物表达载体PCBI1900对甘蔗胚性愈伤组织进行遗传转化。 具体操作过程如下 1、胚性愈伤组织的诱导 以优良甘蔗栽培品种(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效快速的甘蔗转基因方法，其特征在于：包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程、农杆菌的活化及胚性愈伤组织的转化过程、胚性愈伤组织的分化再生及筛选过程、转化小植株ＤＮＡ／ＲＮＡ微量提取及ＰＣＲ与ＲＴ－ＰＣＲ鉴定过程； １）、甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程：以优良甘蔗栽培种的顶端生长点处的幼叶组织为外植体，外植体经消毒、无菌水冲洗、无菌滤纸吸干其表面的水分后切成薄片接种于诱导培养基上，于避光条件下进行培养至诱导出胚性愈伤组织；所述诱导培养基是以ＭＳ培养基为基础培养基，并添加１－２ｍｇ／基是以ＭＳ培养基为基础培养基，并添加５ｍｇ／ＬＩＢＡ、２５０ｕｌ／ＬＰＰＴ、３０ｇ／Ｌ蔗糖、８ｇ／Ｌ卡拉胶、５０－１００ｍｌ／Ｌ椰子汁； ４）、转化小植株ＤＮＡ／ＲＮＡ微量提取及ＰＣＲ与ＲＴ－ＰＣＲ鉴定过程：按编号剪取单株单瓶培养于壮苗生根培养基上的抗性植株的叶片，剪碎后置于液氮中冷冻３－８秒，研碎，用ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ，然后进行ＰＣＲ检测；经ＰＣＲ检测为阳性的植株用同样的方法提取ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ检测；最后将ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ检测均呈阳性的植株从培养基中取出洗净炼苗后移栽到大棚。Ｌ ２，４－Ｄ、３０ｇ／Ｌ蔗糖、８ｇ／Ｌ卡拉胶； ２）、农杆菌的活化及胚性愈伤组织的转化过程：将含有目的基因的农杆菌ＥＨＡ１０５单菌落接种到活化培养基中震荡培养，通过离心回收菌体，再重悬于等体积ｖｉｒ基因诱导培养基中继续震荡培养，以诱导农杆菌质粒ｖｉｒ基因的表达，此菌液即为转化用的农杆菌工程菌液；将甘蔗胚性愈伤组织转入农杆菌菌液中，浸泡后再接种于共培养培养基上于黑暗条件下共培养，然后接种于分化培养基上；所述活化培养基是以ＹＥＰ为基础培养基，并添加相应抗生素Ｋａｎ ５０μｇ／ｍＬ，Ｓｔｒ５０μｇ／ｍＬ，Ｒｉｆ ５０μｇ／ｍＬ；所述ｖｉｒ基因诱导培养基是以ＭＳ培养基为基础培养基，其中大量元素修改为原含量的１／５，并添加１ｍｇ／Ｌ２．４－Ｄ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ果糖、１０ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖、３０ｇ／Ｌ蔗糖、１００－１５０μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮；所述共培养培养基是以ＭＳ培养基为基础培养基，其中大量元素修改为原含量的１／５，并添加１ｍｇ／Ｌ２．４－Ｄ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ果糖、１０ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖、３０ｇ／Ｌ蔗糖、１００－１５０μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮、卡拉胶２０ｇ／Ｌ；所述分化培养基是以ＭＳ培养基为基础培养基，并添加１ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ、０．２ｍｇ／ＬＫＴ、３０ｇ／Ｌ蔗...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张树珍，王文治，冯翠莲，杨本鹏，蔡文伟，王俊刚，熊国如，吴涛，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]
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